苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。     

海萝藻(Gloiopeltis furcata)多糖的提取分离及其结构表征

以海萝藻(Gloiopeltis furcata)为原料,依次经冷水、热水和热碱溶液提取,从中获得了3种多糖(GFW,GFH和GFA),其得率分别为57.9%,2.5%和2.6%。运用气相色谱法(GC)、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、红外光谱(IR)及核磁共振碳谱(13C-NMR)等方法对其单糖组成、分子量以及结构进行了分析。结果表明,GFW和GFH都只含有D-半乳糖(Gal)和3,6-内醚-L-半乳糖(AnG),而GFA除了含有Gal和AnG外,还有木糖;3种多糖的分子量分别为22.6 kD,26.5 kD和49.8 kD;硫酸基含量分别为31.2%,25.1%,22.7%。IR和13C-NMR数据均表明其硫酸基在半乳糖残基C6位。结论:海萝藻中多糖均为硫酸多糖,其中2种为硫琼胶,另一种为含有木糖的硫酸半乳聚糖。     

实验室海月水母大规模解体的初步研究

本实验针对两次突发的饲养海月水母(Aureliaaurita)大规模烂洞解体状况,通过对病灶处进行细菌培养,从其中每次发病水母中均各分离到2种优势病原菌菌株,利用PCR扩增和DNA测序技术,获得优势菌株16SrRNA基因序列,通过生物信息比对分析显示,导致两次海月水母发病的病原菌菌株分别为2种嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)和2种弧菌(Vibrio splendidusVibrio neptunius)。通过利用福林酚法进行此四种优势菌株的细菌发酵培养液蛋白酶活性的测定,结果显示,此4种细菌均具有较强的蛋白酶活性。根据实验结果推测,分离所得的2种嗜冷杆菌菌株(Paa1Paa2)和2种弧菌菌株(Vaa1Vaa2)作为此次发病海月水母的病原菌,有可能均是通过分泌胞外蛋白酶侵蚀水母伞体,从而导致伞体烂洞解体。通过本次实验分析,推测自然条件下水母暴发后的快速消亡是由水母自身免疫下降与细菌侵染的共同作用导致。     

海洋微藻多糖微波提取法研究

选取自养小球藻(Chlorella autotrophica)为实验材料,采用微波法提取多糖,以温度、时间、pH以及微波功率4个因子建立正交实验,考察单因素影响情况。实验结果表明,在温度70℃、时间30min、pH为7、功率为600W条件下粗多糖的产率最高,为291.13mg/g(粗多糖/干重),远高于传统热水浸提法所得粗多糖产率(78.52mg/g,粗多糖/干重),且所得粗多糖与热水浸提法获得的粗多糖具有相似的红外光谱。说明,在一定的实验条件下,与热水浸提法相比,微波提取法不仅不会破坏多糖的结构,还有耗时短、有较高的多糖产率的优势。     

南麂岛海洋沉积物中抗大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病弧菌的放线菌分离和筛选研究

采用平板涂布法从南麂岛近海海洋沉积物样品中分得86株放线菌,用琼脂块法和杯碟法结合筛选出对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)两种大黄鱼病原性弧菌具有不同拮抗作用的海洋放线菌5株,其中编号NJR0956的菌株对两种致病菌的抑菌圈直径均25mm,表现出较强的抑制作用;进而测定了5株活性菌株的抗菌谱。结果表明,它们对指示菌中的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)四种病原弧菌均具有较好的拮抗作用;在对NJR0956的抑菌效果研究中发现,该菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中不仅能够增殖,而且能够有效地抑制病原菌的生长。     

养殖近江牡蛎致病弧菌的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌,人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组.3株细菌均为革兰氏阴性,短杆状,能运动.常规生理生化和Biolog 细菌鉴定系统测试结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V. proteolyticus亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V. carchariae亲缘关系最近.为了进一步确定它们的分类学地位,分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列,分析相关细菌相应序列的同源性,并构建系统进化树.结果表明, 菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近.因此菌株A3G-2、A2G-5B 和B1X-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌.组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊,表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落,管腔扩大,进而管壁解体,消化盲囊出现大面积受损.     

厚叶切氏海带多糖的提取分离及其结构表征

本文以厚叶切氏海带(Kjellmaniella crassi folia)为原料,经提取分离获得4种多糖(KW1,KW2,KA1和KA2).运用电泳、高效液相色谱(HPLC)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)及核磁共振氢谱(1H-NMR)法分别对其单糖组成、相对分子量(Mr)以及结构进行分析.结果表明,KW1与KA1是Mr为520 kD和430 kD且M/G(6.14和1.90)显著不同的褐藻胶;KW2是以岩藻糖(82％)为主的岩藻糖硫酸酯;KA2是以半乳糖(34％)、岩藻糖(27％)和甘露糖(21％)为主的杂聚硫酸多糖.KW2和KA2的Mr和硫酸基含量分别为536 kD和427 kD及30％和21％.经1 H-NMR分析表明,KW2的硫酸酯基主要存在于岩藻糖残基的C2和C4位.     

厚叶切氏海带多糖的提取分离及其结构表征

本文以厚叶切氏海带(Kjellmaniella crassifolia)为原料,经提取分离获得4种多糖(KW1,KW2,KA1和KA2)。运用电泳、高效液相色谱(HPLC)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)及核磁共振氢谱(1H-NMR)法分别对其单糖组成、相对分子量(Mr)以及结构进行分析。结果表明,KW1与KA1是Mr为520 kD和430 kD且M/G(6.14和1.90)显著不同的褐藻胶;KW2是以岩藻糖(82%)为主的岩藻糖硫酸酯;KA2是以半乳糖(34%)、岩藻糖(27%)和甘露糖(21%)为主的杂聚硫酸多糖。KW2和KA2的Mr和硫酸基含量分别为536 kD和427 kD及30%和21%。经1H-NMR分析表明,KW2的硫酸酯基主要存在于岩藻糖残基的C2和C4位。     

养殖近江牡蛎致病弧茵的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌，人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组。3株细菌均为革兰氏阴性，短杆状，能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明，菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近，菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V．proteolyticus亲缘关系最近，菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V．carchariae亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位，分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列，分析相关细菌相应序列的同源性，并构建系统进化树。结果表明，菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近，菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近，菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近。因此菌株A3G-2、A2G-5B和BIX-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌。组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊，表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落，管腔扩大，进而管壁解体，消化盲囊出现大面积受损。     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。     

毛蚶血浆中抗菌蛋白的纯化及抗菌活性研究

采用硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25柱脱盐和Bio—gel P-10柱层析等方法,从毛蚶(Scapharca subcrenata)血浆中分离纯化出了抗菌作用较强的蛋白组分。结果表明,该抗菌蛋白组分对供试革兰氏阳性细菌即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和四联微球菌(Micrococcus tetragenus)具有较强的抑菌活性,而对供试革兰氏阴性细菌即大肠杆菌(Escherichia coli)、普通变形菌(Proteus vulgaris)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)无抑菌活性;对供试真菌尖镰孢(Fusarium oxysporum)、细链格孢(Alternaria tenuis)、黑曲霉(Aspergillus niger)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的菌丝生长有一定的抑制作用,对柑桔青霉(Penicillium citrinum)和松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)无抑菌作用。性质试验表明,该抗菌蛋白组分具有很好的热稳定性,120℃处理30min其抑菌活性仍保持85％以上,对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感。     

泥蚶血红蛋白异源四聚体酶解多肽抗菌活性及其机理研究

采用凝胶层析技术从泥蚶血细胞裂解物中纯化得到两种血红蛋白Tg-HbⅡ(异源四聚体)和TgHbⅠ(同源二聚体),回收率分别为48.15%和24.91%。胰蛋白酶酶解Tg-HbⅡ,酶解液经反相C-18色谱柱分离纯化得7种血红蛋白源多肽F1~F7。通过琼脂扩散法检测酶解多肽抑菌活性,结果发现7种多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌均无抑菌作用,但多肽F2~F7对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌具有明显抗菌活性,且多肽F2~F7对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌的MIC值在0.012~0.200mg/mL范围内。荧光显微镜观察酶解多肽杀菌效果发现多肽杀菌迅速,5min内弧菌细胞几乎全部死亡。利用透射电子显微镜观察正常的和经抗菌肽处理后的溶藻弧菌和哈维氏弧菌细胞的超微结构,结果显示,对照组正常细胞内部结构完整,而经抗菌肽处理过的细胞其细胞壁完整,但因缺乏细胞内容物支持导致局部区域内陷,细胞质膜明显收缩,细胞内物质外流形成许多空泡从而导致细胞死亡。研究结果表明血红蛋白源抗菌肽对泥蚶致病菌弧菌有明显的抗菌活性,其通过破坏细胞内部结构而起到杀菌作用,这些发现为血红蛋白抗菌机制的研究奠定了基础。     

Adhesion of pathogenic Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea

Adhesion of Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea has been investigated using [methyl—3H]thymidine as isotope tracer. The results showed that: the adhesive quantity of V. alginolyticus increased with bacterial concentrations and reached equilibrium after incubated for 180 min; the higher adhesive quantity was obtained at 15~30 ℃ and sourish conditions; adhesion of V. alginolyticus could not achieved without Na , and Ca2 played an auxiliary role in the bacterial adhesion; adhesion of V. alginolyticus was inhibited remarkably by starvation, heat treatment and periodic acid treatment; all of the eight kinds of carbohydrates investigated enhanced the adhesion of V. alginolyticus to the gill mucus of P. crocea, among them, glucose, mannose, fructose and maltose showed the specially enhanced adhesion. The results indicated that V. alginolyticus could adhere to the gill mucus of P. crocea facilely in seawater, and this bacterial adhesion was influenced by environmental factors and closely related to superficial carbohydrate structures and some heat-sensitive structures.     

病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用.结果表明,溶藻弧菌的黏附量随着菌浓度的增加而升高并在180 min后达到饱和;在温度15~30℃、pH偏酸条件下黏附作用较强,Na+是溶藻弧菌黏附作用必需的,Ca2+起着辅助作用;溶藻弧菌经营养饥饿、热处理及高碘酸处理后黏附作用有明显下降;8种碳水化合物都有不同程度的促进溶藻弧菌的黏附作用,其中葡萄糖、甘露糖、果糖及麦芽糖有明显促进作用.研究结果表明:海水中的溶藻弧菌可很好地黏附于大黄鱼鳃黏液,其黏附作用受环境因子影响,并且与溶藻弧菌的表面碳水化合物、热敏结构等有着密切关系.     

海洋放线菌对大黄鱼病原弧菌的拮抗作用和抗菌谱

在大黄鱼（Pseudosciaena crocea)病原弧菌的拮抗放线菌筛选和人工诱变基础上，选择出对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌（V.paradaemolyticus)同时具有较强拮抗作用的4株放线菌，采用琼脂块法测定4株放线菌的抗菌谱，并检测4株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用，结果表明：4株放线菌的抗菌谱均较窄，在固体和液体培养基中对2种病原弧菌都有较强的拮抗作用。     

龙须菜和扁江篱多糖的组成及其抗肿瘤效果

于１９８５－１９８７年期间用冷水和热水对采集于青岛的龙须菜和扁江篱的琼胶型多糖进行提取。两海藻的热水提取多糖都通过ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０色谱桩用热水和不同浓度ＮａＣｌ深液前后进行洗脱分级。龙须菜和扁江篱多糖的主要级分分别为０．５ｍｏｌ／Ｌ和１．０ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ洗脱级分。对各级分做化学分析及ＩＲ和＾１３ＣＮＭＲ光谱分析。结果表明，龙须菜多糖由琼二糖、琼胶糖前体和６－ＯＣＨ３－琼二糖组成     

中国对虾养成期细菌性黑鳃,褐斑综合症的病原生物学研究

本文是对中国对虾黑鳃、褐斑综合症进行病原菌分离和人工感染试验的报告。经细菌学鉴定表明,分离菌分别为海弧菌Vibrio pelagius Baumann和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus sakazaki。人工感染试验显示,海弧菌是引起对虾黑鳃、褐斑综合症的主要病原菌,溶藻弧菌的合并感染导致对虾败血死亡。此外还应用电子显微镜对分离纯化的病原细菌进行了超微结构观察。     

三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究

为进一步搞清养殖梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病机理,找到有效的防治方法,2002-2004年在浙江省宁波、舟山等地养殖场,从濒死的梭子蟹体内分离出1205-11和1205-21两株菌。通过菌体形态、培养特性和生理生化反应,鉴定这2株菌分别为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)。人工感染试验证实,这2株菌是梭子蟹肌肉乳化病的病原菌,葡萄牙假丝酵母为继发性感染病原,蟹体外部的损伤及蟹之间相互残伤可能是传染的主要途径。