两个龙须菜新品系经济性状及琼胶特性的初步研究

2008年2～5月在广东省南澳县深澳海区对选育的龙须菜新品系07-1,07-2和对照组福建宁德栽培的981品系进行海上栽培比较试验,测定了3个品系的藻体日平均生长速率,试验了敌害生物(藻钩虾和团水虱)对3个品系的影响,比较了琼胶特性.结果显示,在水温11～20 ℃,盐度32.4～32.8的条件下,品系07-1,07-2的藻体日平均生长速率分别为3.8%/d和4.1%/d,宁德栽培品系的藻体日平均生长速率为3.2%/d.品系07-1,07-2的生长适应水温下限为16 ℃,比宁德栽培品系降低了2 ℃.与宁德栽培的981品系相比较,选育的龙须菜品系07-1,07-2对藻钩虾和团水虱有较强的耐受能力.品系07-1,07-2的琼胶含量比福建宁德栽培的981品系分别提高10.0%和14.4%,凝胶强度也分别提高了5.46%和14.5%,表明2个新品系具有潜在的推广应用价值.     

龙须菜RSAP分析及其SCAR标记的转化

初步探讨限制性位点扩增多态性(Restriction site amplified polymorphism,RSAP)分子标记技术在龙须菜遗传多样性检测和种质鉴定上的应用。利用所优化的适合于龙须菜RSAP分析的PCR反应体系,对青岛湛山湾野生群体和栽培品系981、07-2进行遗传多样性分析和比较。试验采用15对引物组合在3个群体14个龙须菜个体中共扩增出669个位点,其中多态位点数为146个,多态性比例22%,平均每对引物产生10条多态性条带,片段大小在100~1 000 bp之间。湛山湾野生群体的Na(1.007 5)、Ne(1.007 1)、H(0.003 6)、I(0.005 1)与栽培品系981的Na(1.003 0)、Ne(1.002 1)、H(0.001 2)、I(0.001 8),以及栽培品系07-2的Na(1.009 0)、Ne(1.006 3)、H(0.003 7)、I(0.005 4)相比较可知3个群体的遗传多样性是有差异的。种群间的遗传多样性分析表明,在所有检测的样品中,遗传多样性多来自不同群体间的多样性。群体遗传结构分析表明,2个栽培品系981、07-2间遗传距离不大,但栽培品系与湛山湾野生群体间的遗传距离相对较大,而UPGMA聚类分析也明显的将湛山湾野生群体与栽培品系981、07-2区分开来,表明野生群体与栽培品系间已产生一定的遗传隔离。通过分析湛山湾野生群体及栽培品系981、07-2的RSAP指纹图谱,从中筛选栽培品系981的特异条带,并将其转化为稳定性好、特异性高的序列特征化扩增区(Sequence characterized amplified regions,SCAR)分子标记。     

环境因素对胶州湾栽培龙须菜的影响及生长预测模型构建

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是重要的养殖海藻,研究海区栽培状态下龙须菜生长与生态因子变化的响应规律具有重要科学意义,并可以为龙须菜栽培实践和管理提供科学依据。通过对海区实时监测,关注了龙须菜良种(981和鲁龙1号)的生长速率和海区营养盐、水温、光照等因素变化。其中温度、光照、海水溶解碳、氨态氮、磷和pH有显著的变化(p0.05),其余因素变化比较平稳。相关性分析表明,光周期与龙须菜生长具有极显著的相关性(p0.01),硝态氮与龙须菜生长有显著相关性(p0.05)。通过逐步回归的方法构建回归方程:Y_(SGR)=5.794X_(光周期)-76.932(R~2=0.511),来表述龙须菜生长速率与环境因素的关系。     

龙须菜四分孢子体发育过程的WGCNA分析

龙须菜是一种重要的产琼胶海藻,对其繁殖发育的研究将有助于了解龙须菜的生长,有助于育种。本研究对龙须菜不同育性品系(981和鲁龙1号)在不同发育阶段的表达谱数据,采用加权基因共表达网络分析(WGCNA)方法构建基因共表达网络,共获得32个模块。其中,模块最大基因数量为2 577个,最小基因数为66个。经过筛选发现与品系相关的模块(以0.7为阈值)共5个,涉及基因共2 301个,对模块基因进行GO功能富集分析,结果表明主要富集以下功能上:信号转导、转运、细胞分化、翻译、细胞稳态、生物合成过程等。981品系与鲁龙1号品系的富集结果对比表明981品系在孢子放散过程中生物活性不高,生物合成水平较低,内环境稳态较差。经过KEGG富集,筛选到21个与981品系II期四分孢子形成相关的备选基因,主要富集到DNA复制和染色体形态变化等与细胞周期相关的功能上,表明981品系在孢子形成时期的细胞分裂可能出现异常。本文结果为进一步深入揭示龙须菜四分孢子体发育分子调控机制提供思路和导向。     

龙须菜(Gracilariopsis)/江蓠(Gracilaria)的生长和种质特性分析

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是具有重要经济价值和生态效益的大型红藻, 主要用作琼胶提取原料和鲍的饵料。本研究利用生理生化、液相色谱-质谱联用和氨基酸分析等方法, 比较了龙须菜(Gp. lemaneiformis) (wt、981、Gl-1、Gl-s、Gl-g)、异枝龙须菜(Gp. heterocla, Gh)和细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata var. liu, Gt)的生长及藻胆蛋白、琼胶、红藻糖苷和氨基酸等的差异, 以期为龙须菜/江蓠栽培中的种质区分及选择提供参考。结果表明Gt在23 ℃和30 ℃条件下生长均最快, 其相对生长速率分别为野生型龙须菜(wt)的2.19倍和2.49倍。龙须菜Gl-s中藻胆蛋白浓度最高, 为wt的1.91倍。除了Gt之外, 其余6种藻中琼胶产率较高(16.22%~18.91%)。Gt中红藻糖苷和海藻糖积累最多, 分别为wt的3.50倍和1.81倍。Gl-g、Gl-s、Gt和Gh多糖丰富, 在36.89%~40.23%; 龙须菜981、Gl-1、wt和Gl-s总氨基酸浓度较高, 在152.35~161.32 mg·g^–1干质量之间, 并且981、Gl-1、Gl-s氨基酸评分较优。综合以上结果, 龙须菜981、Gl-1和Gl-s的藻胆蛋白、琼胶和氨基酸等均显著优于其他藻, 并且生长较快, 可用于琼胶、藻胆蛋白及多糖的提取或鲍的饵料; 而细基江蓠繁枝变种生长快、红藻糖苷和海藻糖丰富, 可大规模栽培用作鲍的饵料。该研究为丰富及开发利用中国大型海藻种质资源提供了重要的资料。     

光照和营养盐胁迫对龙须菜生长及生化组成的影响

以龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为实验材料,分别研究了光照强度、营养盐胁迫对其生长及生化组成的影响。结果表明,在800～3000lx的范围内随光强的升高,龙须菜生长率增加,但藻红素(PE)、叶绿素a、蛋白质和可溶性总糖含量却降低,即低光强更利于龙须菜生化组分的积累。饥饿处理组、饱和处理组及正常对照组的生长率分别为0.9%,5.01%,3.06%。饥饿处理组的总C含量最高,总N及C/N比值高(>15),饱和处理组则相反,C/N比值<10,即存在C高N低、N高C低的现象。表明水体营养状况对龙须菜生长、体内生化组分有显著影响。总C、总N及C/N比都能很好地反映藻体的营养状态。饱和处理组藻体呈现深红色,饥饿处理组藻体色泽为浅黄色,因此也可根据藻体色泽的变化来估计藻体的营养状态。     

低盐胁迫后两种龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)叶绿素荧光特征的对比分析

以龙须菜981品种和其绿色突变型为材料, 运用叶绿素荧光分析技术, 比较低盐胁迫(盐度28和22)下二者光合生理的差异。研究结果证实, 在正常状态下, 龙须菜绿色突变型具有较高的光能利用效率(α)、最大相对电子传递速率(r_ETRmax)、半饱和光强(I_k)和光性能指数(P_Iabs), 表明其光合性能优于龙须菜981。在2种低盐条件下培养3 d, 盐度28处理后, 龙须菜981的最大相对电子传递速率下降了20.4%, 而龙须菜绿色突变型无显著变化, 表明盐度28可使龙须菜981的光合活性减弱。在盐度22培养3 d后, 龙须菜981的最大光量子产量(F_V/F_m)下降幅度高达16.0%, 而龙须菜绿色突变型的下降幅度为11.9%; 龙须菜981电子传递的量子产额(φ_EO)下降了20.3%, 而龙须菜绿色突变型则无显著变化; 另外, 盐度22处理后, 龙须菜981的光能利用效率和最大相对电子传递速率分别下降31.5%和22.1%, 下降幅度均高于龙须菜绿色突变型, 这表明龙须菜绿色突变型光合活性对低盐胁迫的耐受性高于龙须菜981。     

龙须菜微卫星DNA标记筛查及系统分析

利用生物信息学方法,从龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)公共核苷酸数据库中筛查到8条含有微卫星DNA的序列,并根据筛查出的微卫星DNA序列设计合成了5对引物,此外还使用了细江蓠的4对已知微卫星DNA引物共9对引物在采集自青岛的26株野生龙须菜个体中进行扩增,结果筛选到2对引物可扩增出具有多态性的产物.然后利用5对龙须菜的微卫星引物对6个龙须菜品系和另外2个种外物种细基江蓠和菊花心江蓠进行系统学分析.根据计算得到的不同样品之间Nei氏遗传相似系数进行聚类分析,显示青岛野生龙须菜QD与栽培品系981、石岛的龙须菜样品SD与龙须岛的龙须菜样品LD之间的遗传相似系数最高,而来自委内瑞拉的龙须菜样品LV与青岛野生龙须菜之间的差异远远高于种内水平的差异.     

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)高温逆境代谢产物的GC-MS 分析

利用固相微萃取(SPME)和气相色谱/质谱联用技术(GC-MS)分析龙须菜在高温逆境中可挥发性代谢产物的变化规律.最优分析条件为样品60℃平衡30min,用聚二甲基硅氧烷.二乙烯基苯纤维头(PDMS/DVB)顶空萃取吸附25min,在210℃下解吸附5min后对解吸物进行GC-MS检测.结果表明,从龙须菜中检测到56个挥发性代谢产物,在高温逆境条件下主要有烯烃(61.67%)、醛(22.47%)、酮(5.98%)、烷烃(1.92%)、卤代物(0.65%)、醇(0.41%)、酯(0.37%)、其它(1.34%).比较了常温和高温逆境培养条件下龙须菜中代谢产物的相对含量变化规律:高温胁迫下E-2-戊烯醛等7种代谢产物含量显著减少,三氯甲烷等4种代谢产物含量显著增加.其中E-2-庚烯醛、E,E-2,4-庚二烯醛、2-正戊基呋喃和三氯甲烷可能与龙须菜高温逆境生理有关.本研究可为龙须菜抗逆生理和抗高温品系选育提供理论依据和指导.     

龙须菜栽培与遗传育种

龙须菜是一种重要的产琼胶海洋红藻,富含多种活性成分。从1950年代即开始栽培,目前龙须菜/江蓠在中国大型栽培海藻中产量占第二位,2018年产量超过30万t干品,栽培面积达到90 km~2。目前通过全国水产原种和良种审定委员会审定的栽培龙须菜品种有龙须菜"981"、"2007"和"鲁龙1号"三个。龙须菜栽培不仅具有较大的经济效益,也具有较好生态价值。本文介绍了龙须菜人工栽培的技术进步历史、产业分布与发展、对生态环境保护的作用、新品种特性与应用,梳理了龙须菜琼胶合成途径研究和诱变育种技术进展,并对龙须菜栽培产业面临的挑战与未来发展进行了展望。     

龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选

用紫外线辐射处理野生型龙须菜果孢子体放散刚附着的果孢子,并通过耐高温的筛选,初步获得了2株具有耐高温,生长快速等优良性状的四分孢子体突变株,命名为BZT-11和BZT-18,将其与981和野生型藻株进行了比较分析。结果显示,这2株突变体在实验室内和海上的日平均生长速率为均明显高于981和野生型藻株。在热胁迫时间内,BZT-11和BZT-18的丙二醛(MDA)含量均明显低于野生型,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显高于野生型;而在整个胁迫过程中2株突变体与981藻株的MDA含量和SOD活性水平差异不显著。经过4h的热激后,藻株BZT-11和BZT-18的hsp70基因表达水平也显著高于野生型。这些结果进一步证明了该2株突变藻体的耐高温优势。本研究提供了耐高温突变体的筛选技术。     

广东南澳岛大型海藻龙须菜与浮游植物对营养盐的竞争利用

广东南澳岛近海是我国龙须菜养殖的重要基地。为了探究龙须菜养殖对藻华防治的贡献,分别于2016年3月、5月和6月在广东南澳岛北部海域不同养殖功能海区进行采样,研究龙须菜养殖前后海水中营养盐含量和结构的变化,分析不同粒径的浮游生物对有机营养盐的水解利用,探讨龙须菜养殖对浮游植物竞争利用营养盐和生长产生的影响。结果表明,研究海区水质较清洁,无机氮磷含量较低,春季至夏季,随着龙须菜和浮游植物生物量增加,溶解无机磷(dissolved inorganic phosphorus,DIP)浓度不断下降,至6月南澳海区成为磷限制海域。在5月龙须菜生长高峰期,龙须菜养殖区和龙须菜鲍鱼混养区的DIP浓度显著低于鲍鱼区和非养殖区,龙须菜养殖区的叶绿素a浓度明显低于其他区域,亮氨酸氨肽酶(leucine amino peptide,LAP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)活性显著升高,表明龙须菜养殖区浮游植物受到较为明显的营养胁迫。而龙须菜收割后,该养殖区的叶绿素a含量则显著上升,甚至高于其他区域。该结果表明在南澳岛海域,龙须菜养殖通过营养竞争关系(尤其是磷)抑制浮游植物的生长,大规模龙须菜养殖可能有助于抑制有害藻华的发生。     

龙须菜hsp和gln基因克隆及其在不同品系发育过程中表达分析

从龙须菜鲁龙1号、981品系不同发育阶段转录组数据中,挑选差异表达显著基因——hsp、gln,对其上游与全基因序列测序分析。Hsp中8个保守位点均处HSP20结构域内。Gln具谷氨酰胺合成酶N结构域和龙须菜特有的两个跨膜区与低复杂性区域。2个基因表达均可能受缺氧、光照、茉莉酸甲酯等环境及植物激素调控影响。利用荧光定量技术发现不同品系龙须菜的发育过程中hsp与gln表达水平的变化趋势相似。hsp表达水平在Ⅰ到Ⅲ阶段缓慢上升,在Ⅳ阶段大幅升高,这可能与藻体表面伤口的修复相关。gln表达水平在Ⅰ到Ⅱ阶段上升,在Ⅱ到Ⅳ阶段下降,于Ⅳ阶段最低,gln可能与四分孢子囊形成相关。在龙须菜不同品系中2基因表达水平存在差异,这可能与两品系不同的育性表现相关。     

利用代谢组学揭示脱落酸对高温胁迫龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)的作用机制

大型经济海藻龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)在我国南北方海域广泛栽培,但其栽培周期与产量受到夏季高温天气的制约。植物激素脱落酸(ABA)在高等植物生长发育和抗逆胁迫中发挥了重要作用,但在藻类中研究较少。为揭示ABA对高温胁迫下龙须菜的保护作用及其潜在的作用机制,采用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS/MS)研究了外源ABA对高温胁迫下龙须菜代谢产物的影响。结果表明,ABA处理72 h后龙须菜中104种代谢物发生变化,其中黄嘌呤、次黄嘌呤、芦丁、精氨酰琥珀酸等26种代谢物含量升高,而23种溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和35种溶血磷脂酰胆碱(LPC)含量下降;嘌呤代谢、黄酮和黄酮醇合成以及抗坏血酸和醛酸盐代谢这3条代谢通路受ABA影响显著。最后,利用生理生化方法检测了黄嘌呤对高温胁迫下龙须菜生长速率和活性氧(ROS)的影响,以及ABA添加后两种溶血磷脂代谢酶活性、精氨酰琥珀酸合成酶及其基因表达的变化,发现藻的生长、酶活性或基因表达变化等与代谢组结果相吻合。可见,ABA可以通过激活嘌呤代谢、黄酮和黄酮醇合成以及抑制溶血磷脂合成等来保护高温胁迫下的龙须菜。研究结果丰富了藻类中植物激素抗逆胁迫的资料,为龙须菜耐高温品系选育提供了新的思路。     

龙须菜果孢子的X射线诱变及优势突变体的筛选

采用X射线作为诱变源,对龙须菜进行辐照诱变,验证了果孢子作为诱变材料相对于龙须菜藻尖的优越性,并确定了最佳诱变剂量-90Gy。约10~7~10~8个野生型龙须菜果孢子经过90Gy的X射线辐照,获得了约10~6~10~7株成活的龙须菜幼苗。将诱变存活幼苗平均分成2组,分别对其进行耐高温和低磷速生品系的筛选。经过幼苗期和成熟期的双重筛选,初步获得了1株耐高温突变株和3株低磷速生突变株。分别命名为WT-3和WLP-1、WLP-9、WLP-22。其中,WT-3为经历了41和35℃高温胁迫后仍存活并保持良好生长的藻株;WLP-1、WLP-9、WLP-22在10~(-2) mg/L的磷浓度水平下相对野生藻株具有显著的生长优势。本研究提供了一套可行有效的龙须菜诱变筛选技术,同时,筛选出的优良藻株为下一步遗传研究和生产应用提供了材料。     

条斑紫菜杂交重组品系(A-18)的筛选与特性分析

为筛选出藻体生长快且颜色与野生型色泽相近的条斑紫菜新品系，本研究从条斑紫菜绿色突变体和红色突变体种内杂交产生的后代中，分离出了优良品系A-18。日龄60 d时的叶状体平均长度、长宽比和单株湿质量，A-18品系分别为84.95 cm、49.46和0.52 g，分别是条斑紫菜野生型品系（WT）的3.12、7.01和1.36倍。日龄60 d时叶状体的叶绿素a和总藻胆蛋白含量，A-18品系分别为8.37和53.81 mg/g，均与WT品系较接近。日龄60 d时的叶状体平均厚度，A-18品系仅为20.22 μm，比WT品系降低了29%。另外，A-18品系的壳孢子放散总量为916.01万个/贝壳，是WT品系的1.55倍。综上所述，A-18品系具有生长快、长宽比值大、藻体薄、壳孢子放散量大等优良特性，且藻体颜色与野生型色泽相近，有望在生产中运用。     

不同产地龙须菜光合色素的比较研究

龙须菜是一种重要的产琼胶海藻。本文分析了从青岛、石岛、龙须岛采集的龙须菜的光合色素组成、光谱特性、光合作用速率及生长速度,从而研究扑光色素的组成与光合作用、生物物质积累之间的关系。三个龙须菜的产地之间相距上百里到几百里,彼此之间进行遗传物质交流的机会较少,存在着地理隔离的可能性。本研究表明,不同产地龙须菜光合色素的组成有差异:青岛的材料藻红蛋白含量较高,石岛及龙须岛材料叶绿素α含量较高。不同产地的材料荧光光谱也有差异。与其他产地的材料相比,龙须岛材料光补偿点较低,生长速度较快。本文对今后的生产需要提供了一些生物学参数。     

大型海藻龙须菜凋落物分解对水质的影响

大型海藻龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)规模栽培具有重要的经济和环境效益, 但藻体的凋落分解会对栽培区和邻近海域水环境造成一定影响。为探讨龙须菜凋落对水环境的影响, 本文通过45d的室内受控实验, 评估了龙须菜凋落分解过程中水体溶解氧和氮、磷的含量变化。结果发现, 干龙须菜实验组在实验期内水体溶解氧浓度显著降低(较对照组降低了82.81%); 水体氮、磷浓度显著提高, 总氮、总磷浓度较对照组分别上升了161.78%和759.93%。鲜龙须菜+海水+沉积物组在实验前中期(第0~21天)水体溶解氧浓度持续降低(较对照组降低了53.92%), 但在21d后又逐渐恢复至对照组水平; 其水体氮、磷浓度在实验中末期亦显著提高, 分解过程总氮、总磷浓度分别较对照组上升了36.65%和177.80%, 水体氮、磷变化曲线较干龙须菜组平缓且迟滞。鲜龙须菜凋落分解过程中的营养盐释放率低于干龙须菜, 沉积物对鲜龙须菜的分解及氮、磷和碳释放有促进作用, 但对干龙须菜的分解及氮、磷和碳释放有一定程度的减缓作用。龙须菜失重率、分解速率及营养盐释放率均呈现如下规律: 干龙须菜+海水组>干龙须菜+海水+沉积物组>鲜龙须菜+海水+沉积物组>鲜龙须菜+海水组。依据上述结果, 建议在龙须菜规模栽培和收获过程中应及时打捞脱落或衰老藻体, 尤其对已收获的大型海藻应妥善处理, 避免大型海藻腐烂而导致水体污染。     

龙须菜对重金属汞胁迫的生理响应

研究了大型海藻龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)对不同浓度重金属汞(0、0.02、0.04、0.10、0.20和0.40 mg/L)胁迫的生理响应.结果表明:当 Hg2+浓度逸0.02 mg/L 时,龙须菜藻体的相对生长速率显著下降,并且当 Hg2+浓度达到0.20和0.40 mg/L 时,龙须菜出现负增长.随着 Hg2+浓度的升高,龙须菜藻体的最大光化学量子产量、最大净光合速率和表观光合效率逐渐下降,叶绿素 a、类胡萝卜素和藻胆蛋白含量则呈先升高后下降的趋势,且当 Hg2+浓度逸0.10 mg/L 时,叶绿素 a、类胡萝卜素和藻胆蛋白含量显著下降.说明龙须菜在受 Hg2+胁迫的环境中耐受性较差,且 Hg2+对龙须菜的毒害作用较大,当Hg2+浓度逸0.02 mg/L 时,龙须菜藻体的生理活动就会受到显著抑制.     

外源水杨酸对龙须菜生长及生理的影响

以龙须菜Gracilaria lemaneiformis为材料,研究了不同质量浓度水杨酸对龙须菜的生长速率、渗透调节物质、抗氧化酶、藻胆蛋白和叶绿素荧光动力学特性等的影响。结果表明,外施水杨酸可以促进龙须菜的生长,其中水杨酸质量浓度为10 μg/mL的处理组对促进龙须菜的生长效果最好,其日相对生长速率达到6.92%/d,比对照组的相对生长速率增长了26.3%。在用水杨酸处理后的第3天,水杨酸质量浓度为10 μg/mL处理组的各指标达到最大,脯氨酸增长了32.5%、SOD增长了24.3%、藻红蛋白增加了24.6%。同时水杨酸促进了Ca²⁺和K⁺离子在龙须菜藻体内的积累速率。用水杨酸处理后,叶绿素荧光参数ΦPSⅡ在处理后的第5天开始增长,比对照组增长了9.6%;F_v/F_o在第5天达到最大值,比对照组增长了5.6%。本研究表明,适当质量浓度的水杨酸有利于提高龙须菜的生长速率,其中水杨酸质量浓度为10 μg/mL的处理组对龙须菜的处理效果最好。