超低温保存后大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子的生理活性及其超微结构研究

采用计算机辅助分析和电子显微镜方法, 对大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子生理活性(运动率、运动速度和寿命)和超微结构进行观察, 研究其精子经超低温保存后质量变化情况, 得到了新鲜精子的路径速度[(101.91±9.30)?m/s]、运动率(88.30%±2.62%)和寿命[(368.00±111.50)h], 以及冷冻精子的路径速度[(76.78±8.49)?m/s]、运动率(65.60%±4.76%)和寿命[(120.00±12.00)h]。结果表明, 新鲜精子的生理特性好于冷冻精子。同时通过电镜去进行超微结构分析, 发现大菱鲆精子经过超低温保存后, 40%—60%的精子基本保持正常的形态结构, 其余精子遭受不同程度的机械损伤。其中膜损伤为主要损伤, 损伤精子中60%—70%带有膜损伤。推测大菱鲆精子在冷冻解冻过程中遭受到的机械损伤可能是导致冻精生理活性显著下降的主要原因。     

太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液超低温冷冻方法的建立及精子超微结构分析

采用分步降温法冷冻保存太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液,并用扫描电镜和透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤。分析了添加剂(蛋黄)及五种抗冻剂(PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇))不同浓度(8%、10%、12%、14%、16%、18%)对太平洋鳕精子冷冻保存效果的影响。实验结果表明,蛋黄能够显著提高太平洋鳕冷冻保存效果(P0.05);12%PG中添加10%蛋黄保存的冻融精子运动率最高(85.87%±1.6%),显著高于其他冻存组(P0.05)。添加蛋黄的12%浓度的DMSO组解冻后精子运动速率较高,平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、(155.64±12.02)μm/s,与其他各实验组差异显著(P0.05)。通过扫描电镜和透射电镜观察新鲜和冻融后的鳕鱼精子发现,鲜精中75.5%精子形态结构正常、24.5%精子形态结构异常;运动率最高的冻精中67%精子形态结构正常、33%精子形态结构异常。超低温保存对太平洋鳕精子结构产生了显著影响,细胞膜破裂、线粒体肿胀变形,鞭毛脱落、断裂。     

赤点石斑鱼精子的超低温冷冻及短期保存

对赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)精子的激活特点、超低温冷冻方案筛选、短期保存、受精实验等方面进行了研究。结果表明：水温25℃、比重为1.018的海水对赤点石斑精子具有最佳的激活效果,活力为(82.50±4.18)%;在进行超低温冷冻时,选择距离液氮面7 cm的高度进行降温,获得冻后活力为(65.83±3.76)%,显著高于1、3、15 cm 的处理组(P<0.0001),利用冻存液 B(含30 g/L 海藻糖、10%DMSO 的生理盐水)冻存赤点石斑精子,冻精活力为(67.92±3.96)%,显著高于另外两种冻存液(P<0.05);通过优化的方案(冻存液B,7 cm高度)冻存得到精子可获得较好的受精效果,受精率为(74.55±4.31)%,而相应的鲜精受精率可达(87.42±4.63)%,二者间的差异具有显著性(P=0.017);短期保存的结果表明,赤点石斑鱼精子在4℃环境中保存约两周后活力降低为0。     

渗透压、pH、葡萄糖及离子溶液对夏牙鲆精子激活及运动特征的影响

作者通过渗透压计分别测定各溶液的渗透压值,通过CASA精子分析系统,测定精子运动参数,分析、比较了渗透压、pH、葡萄糖及离子溶液对夏牙鲆(Paralichthys dentatus)精子激活及运动特征的影响。结果表明:夏牙鲆精子激活的渗透压范围为581~1260 mosm/kg;在特定的渗透压范围内(单位为mosm/kg),A组(581~650),B组(762~877),C组(931~1060),D组(1117~1260)中,与NaCl和KCl溶液相比较,葡萄糖溶液可以显著提高夏牙鲆精子激活后的运动率;在相对高渗条件下(1091~1180),经Ca Cl2400、EGTA400和无Ca~(2+)人工海水激活的夏牙鲆精子运动率存在显著差异;且夏牙鲆精子最适的激活p H范围是7~7.5。综上,激活剂的渗透压决定了夏牙鲆精子能否激活并显著影响了激活后精子的运动率,同时葡萄糖、外源Ca2+及p H均在一定程度上影响了精子的运动率。     

大菱鲆精子运动特征与精液pH的相关性研究

为探究大菱鲆(Scophthalmus maximus)精液质量与pH的关系及甘油对大菱鲆精子激活的影响,本研究通过计算机辅助精子分析系统分析检测了威海和烟台4家大菱鲆育苗场(A、B、C、D)的精子质量。研究发现,不同育苗场的大菱鲆精子活力存在显著的差异,A2A1DCB,精子预测寿命分别为11.7、7.1、6.8、4.6、3.3 min,所取精子的质量的存在显著差异。研究结果发现,大菱鲆精子运动特性与精子活化率相关性显著,其中精子活化率与平均曲线运动速度、平均直线运动速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、精子平均鞭打频率呈显著正相关(P0.05),与运动直线性、运动摆动性、运动前向性等参数无显著相关性;大菱鲆精子运动特性受pH影响显著,精液pH与平均曲线运动速度、平均直线运动速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、精子平均鞭打频率呈显著正相关(P0.05),而与运动直线性、运动摆动性、运动前向性等参数无显著相关性。同时还发现,精子活化率高、寿命长的大菱鲆精液pH偏弱碱性(pH=8.0),即大菱鲆精子适宜在弱碱性环境中活动。除此之外,向激活海水中加入梯度甘油(0.1、1、10、100、500、1 000 mmol/L),发现可以显著提高大菱鲆精子寿命,其中甘油浓度为100 mmol/L时,精子寿命延长至15.17 min±0.29 min,推测甘油在精子激活后可能被精子吸收并氧化分解提供能量。     

九孔鲍精子短期保存技术研究

应用单因素试验和三因素正交试验研究了温度、二甲基亚砜(DMSO)浓度及精子密度等因素对九孔鲍(Haliotis diversicolor supertextexta)精子短期保存的影响。单因素试验结果表明: DMSO、维生素C、甘油、葡萄糖等添加剂中仅5%和7. 5% DMSO有利于精子活力的保持; 3个试验温度中28℃精子活力下降速度最快，其次为1℃, 最慢是5℃; 稀释度越高精子活力下降速度越快。正交试验中, 九孔鲍精液分别在25个保存条件下保存96 h, 保存期间每隔一段时间取样观察精子活力。25 个处理的活力变化数据用生长函数拟合, 根据拟合方程计算出精子活力半衰期, 并对结果进行直观分析及方差分析。结果表明, 较理想的精子保存条件是: 温度为7℃, DMSO质量分数为3%, 精子密度为7.5×10⁸个/mL; 各因素对精子活力半衰期的影响按精子密度、温度、DMSO密度顺序递减; 精子密度对精子活力半衰期有显著影响(P<0.05) , 温度及DMSO浓度的影响不显著(P>0.05) 。     

单细胞凝胶电泳用于检测低温保存的真鲷(Pagrosomus major)精子DNA损伤

应用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法,对超低温冷冻保存的真鲷精子DNA的损伤状况进行了检测研究。针对研究对象,在实验过程中对传统的碱性单细胞凝胶电泳在铺胶方法、电泳条件等进行了改进。对精子细胞进行预处理,在碱性电泳液中使核DNA双链解链变性后电泳,EB染色10min后,在荧光显微镜下观察,每次随机观察50个左右的核DNA。结果表明,对荧光显微镜下观察到的精子核按彗尾长度及荧光强度划分等级,出现损伤的精子核DNA的损伤程度主要为轻度损伤和中度损伤,很少见有完全损伤的真鲷精子核。对比真鲷冷冻精液与新鲜精液的精子DNA的损伤状况,表明仅用30%DMSO冷冻精子DNA损伤状况与鲜精差异显著(P>95%),其他冷冻方法保存的精子与鲜精差异不显著(P>95%)。     

金乌贼精子释放及精子活力的研究

以金乌贼(Sepia esculenta)精荚为研究对象,探究了组织蛋白提取液对其中精子释放的影响。实验将活体解剖取出的成熟精荚置于5种组织蛋白提取液中,于19和4℃条件下观察并记录精荚保持完整形态时间及其中精子活力水平。并于19~24℃6个水温梯度下探讨了维持精子活力的最适温度范围。研究表明,水温19时,卵巢蛋白提取液可促进精荚中精子释放(9.5h),而副性腺蛋白、精荚囊蛋白、精巢蛋白和缠卵腺蛋白提取液均对精子释放的影响较小,离体后的精荚可保持完整形态1~2d。水温4℃时,放置于海水中的精荚,其完整形态和部分精子活力可维持较长时间(25和22d),而其他组织蛋白液中保存的精荚2~3d后即无完整个体,精荚中的精子1d后亦无活性。在19~24℃水温范围内,精子激烈运动时间和寿命均随水温升高呈先升高后降低的趋势。在20、21和22℃海水中,精子激烈运动时间分别为(93.33±13.33)、(116.67±6.67)和(93.33±6.67)min,组间差异不显著(P0.05),但高于23和24℃实验组,并显著高于19℃组(43.33±12.02)min(P0.05),在水温21℃时精子寿命达到最大值,为(206.67±6.67)min。通过拟合精子激烈运动时间y和温度x的关系曲线,得出当x=21.49℃时,ymax21.49=100.47min。在90%置信区间内,精子最大激烈运动时间的温度范围为20.22~22.76℃。研究结果表明,卵巢蛋白提取液可促进金乌贼精荚中精子释放,保持精子活力的适宜温度为20.22~22.76℃。     

不同温度保存对黑鲷精子生理特性的影响

分别采用室温(21℃左右)、低温(3—5℃,冰箱)和超低温(-196℃,液氮)保存黑鲷Sparusmacrocephalus(Basilewsky)精子,探讨不同温度保存对黑鲷精子生理特性的影响。在室温条件下,黑鲷精子活力随保存时间的延长而下降,保存4h后的精子失去激烈运动的能力。在低温条件下,黑鲷精子寿命有所延长。黑鲷精子经过超低温保存后,其激活率、受精率与鲜精的接近,精子活力则有所下降。黑鲷新鲜精子在海水盐度为10时能被激活,但经过超低温保存后的黑鲷精子激活所需的最低盐度必需在10以上。     

投喂新鲜、冷冻、烘干菲律宾蛤肉对三疣梭子蟹摄食、代谢及生长的影响

研究了投喂新鲜、冷冻、烘干的菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)肉对三疣梭子蟹(Portunus tritubercula-tus)摄食、代谢及生长的影响。实验结果表明:用干重表示的摄食不同蛤肉的三疣梭子蟹日平均摄食率、特定生长率、饵料转化效率有显著差异:投喂新鲜蛤肉、冷冻蛤肉、烘干蛤肉的蟹日平均摄食率分别为6.15%±0.98%,6.33%±0.91%,10.72%±1.18%,烘干蛤肉组显著高于其他两组(P0.05);日特定生长率分别为2.90%±0.37%,2.23%±0.46%,1.97%±0.30%,新鲜蛤肉组显著高于其他2组(P0.05);饵料转化效率分别为41.57%±5.67%,32.72%±6.60%,17.52%±1.04%,新鲜蛤肉组冷冻蛤肉组烘干蛤肉组(P0.05)。蜕壳率分别为169.23%,160.00%,166.67%。摄食代谢中,饱食后2~4 h内代谢率达到高峰,4~6 h代谢率仍较高但有下降趋势。摄食不同蛤肉的三疣梭子蟹在饱食后0~2 h和2~4 h内新鲜蛤肉组亚硝氮排泄率分别为(0.133±0.008)μg.g-1.h-1和(0.287±0.006)μg.g-1.h-1,显著低于冷冻蛤肉组[(0.180±0.013)μg.g-1.h-1,(0.334±0.007)μg.g-1.h-1]和烘干蛤肉组[(0.197±0.009)μg.g-1.h-1,(0.347±0.034)μg.g-1.h-1],而4~6 h内各组间差异不显著。各处理组氨氮排泄率、耗氧率在饱食后0~2h,2~4 h,4~6 h都有显著差异,冷冻蛤肉组烘干蛤肉组新鲜蛤肉组(P0.05)。新鲜蛤肉组蟹饱食后0~2 h,2~4h,和4~6 h内氨氮排泄率分别为平均每小时(0.689±0.007)μg.g-1,(0.959±0.048)μg.g-1,(0.752±0.028)μg.g-1;耗氧率分别为(0.073±0.003)mg.g-1,(0.099±0.005)mg.g-1,(0.072±0.006)mg.g-1。综合考虑,投喂新鲜蛤肉三疣梭子蟹特定生长率、饵料转化效率最高,氨氮排泄率最低,既有利于提高蟹产量,又有利于清洁生产。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子冷冻前后的活力及超微结构变化

采用两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,并用透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤.结果表明,大黄鱼冻精的激活率、运动时间及寿命与鲜精相比无显著差异.鲜精中28.5％的精子形态结构异常,冻精中37％的精子形态结构异常.形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象,袖套、轴丝及中心粒结构正常,线粒体形态完整、嵴较发达;形态结构异常的精子表现为质膜破裂、脱落,质膜膨胀,核膜破裂、脱落,核局部受损伤,线粒体膨胀、嵴退化或消失,线粒体移位或脱落.结果显示,以Cortland溶液为稀释液,10％ DMSO为抗冻剂,对大黄鱼精子具有较好的抗冻保护作用.     

大西洋庸鲽(Hippoglossus hipoglossus L.)精液脂肪酸分析及激素GnRHa诱导对其组成的影响

采用气相色谱检测的方法,进行大西洋庸鲽精液脂肪酸组成分析及激素GnRHa诱导对其组成影响的研究。结果表明,大西洋庸鲽精液中含量最高的脂肪酸种类为22:6n-3(DHA,二十二碳六烯酸),占总脂肪酸比例25.67%±0.94%;其次为16:0(PA,棕榈酸)、20:5n-3(EPA,二十碳五烯酸);重要必需不饱和脂肪酸20:4n-6(AA,花生四烯酸)含量较低,为1.76%±0.01%。精液中高不饱和脂肪酸(PUFA)含量较高,为44.25%±0.30%;饱和脂肪酸(SAT)含量为27.72%±0.22%。重要脂肪酸比例DHA/EPA为2.33±0.26;EPA/AA为6.30±0.51;n-3/n-6为9.22±0.60。激素诱导未对精液中脂肪酸组成产生显著影响。重要必需脂肪酸DHA、EPA、AA,以及n-3、n-6等重要种类的脂肪酸总量在激素诱导组与非诱导对照组样品间无显著差异;在激素诱导后的三个取样时间的样品间也无显著差异(P0.05)。     

贝藻混养对大西洋鲑养殖废水的生物滤除

养殖废水的综合利用与无公害化处理排放是实现水产养殖业健康可持续发展的重要保障。作者采用太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)及龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)混养和单养的方式处理大西洋鲑工业化循环水养殖系统排放的废水,设置贝类组、藻类组、贝藻组3组处理,探讨了贝藻混养方式和贝类、藻类单养对废水中主要水质因子(N、P营养盐、化学需氧量(COD)和总悬浮颗粒物(TSS))的处理效率,实验周期为30 d。结果表明,牡蛎和龙须菜混养的方式处理养殖废水效果较好,其对氮、磷营养盐、COD及TSS的去除效率分别为:总氨态氮41.67%±8.82%、硝酸盐氮33.96%±0.34%、总磷7.18%±0.03%、COD 78.87%±1.82%和TSS 70.50%±1.65%,而亚硝酸盐氮出现一定的积累。综合分析,牡蛎和龙须菜混养的方式处理养殖废水的效率优于牡蛎和龙须菜的单独处理。     

光色对豹纹鳃棘鲈幼鱼摄食、生长和存活的影响

为探究光色对鱼类摄食、生长和存活的影响,作者在模块化小型循环水养殖系统中,以豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)幼鱼(体长21.2 cm±1.22 cm,体质量112.46 g±2.632 g)为对象,设置5种光色环境(红、黄、绿、白和黑暗),进行了4个月的循环水养殖实验。结果表明:绿光下豹纹鳃棘鲈幼鱼摄食率高、饵料转化率高、饵料系数低,但不同光色下豹纹鳃棘鲈幼鱼的摄食不存在显著性差异(P0.05);幼鱼的体长增长,绿光组和红光组大,且与其余3组间差异显著(P0.05);幼鱼的体质量增长,绿光组最大,红光组和黑暗组次之,白光组和黄光组最小,且三者间差异显著(P0.05);各组幼鱼的肥满度并没有显著性差异(P0.05);除白光组幼鱼存活率(只有50%)最低外,其余各组幼鱼存活率均在80%以上,其中绿光组最高,为88.33%。可见,在循环水养殖生产中,绿光环境有利于豹纹鳃棘鲈幼鱼的摄食、生长和存活。     

星康吉鳗精子的超微结构研究

为探讨星康吉鳗(Conger myriaster)精子的超微结构和形态,应用扫描电镜和透射电镜对星康吉鳗精子结构进行观察。结果表明,精子由头部、中段和鞭毛3部分组成,有其独特的结构,总长度为35.75± 1.15µm。精子头部为新月形,主要由细胞核构成,细胞核内有核泡,无顶体结构。精子头部的质膜内包含单一的线粒体。精子头部长为3.33±0.16 um,头宽为1.12±0.13 um。在精子头部的凸面上,有4条从中段到头端的条纹。精子中段伸出一支根,支根位于精子的中段末端。精子中段长度为0.55±0.05 um,支根长度为1.38±0.08 um、直径为90.48±6.06 nm。精子尾部鞭毛细长,鞭毛横切面呈圆形,无侧鳍,鞭毛的轴丝结构为“9+0”型;一些鞭毛的末端呈现卷曲状,发育机制尚不明确。精子鞭毛长为31.16±1.51µm,鞭毛直径为0.17±0.01µm。通过比较分析发现精子的这些形态学特征不仅表现在星康吉鳗精子,还表现在鳗鲡目其他属的精子;表明是鳗鲡目精子的共同特征。本研究揭示了星康吉鳗精子的形态结构,为突破星康吉鳗人工繁殖技术提供了理论参考。     

中国对虾受精生物学的研究

于１９８８－１９９１年在青岛对中国对虾进行受精能力和受精生物学的研究。对虾采用加温和不加温培育，然后用人工授精法－－水域法和滴管法授精研究精卵受精能力；应用扫描和透射电以及石蜡切片技术，精卵的形态结构和受精过程的变化。结果表明，水域法授精，精子入水后３ｈ仍具有受精能力；卵子入水后１ｍｉｎ之内受精率最高只达６２．７％。而滴客法授精，受精率最高可达到９８％。平均值也在６０－８０％之间。保持在低温的亲虾     

水体中组织胺对日本新糠虾生长、发育和体内组织胺含量的影响

将日本新糠虾(Neomysis japonica)从新孵幼体至性成熟,养殖于不同质量浓度组织胺水体中,其质量浓度分别为0mg/L(对照组),5mg/L(低剂量组,L组),10mg/L(中剂量组,M组),15mg/L(高剂量组,H组),以研究水体中组织胺对日本新糠虾存活、生长和发育的影响及糠虾体内组织胺含量的变化。结果表明,随组织胺质量浓度的升高,日本新糠虾的体长、体质量和存活率均呈现下降趋势;M组和H组日本新糠虾的体长和体质量显著小于对照组(P0.05),而L组与对照组间无显著差异;较高质量浓度的组织胺(15mg/L)能显著降低日本新糠虾的存活率,H组存活率仅为53.92%±3.58%;各组织胺质量浓度组对雄性日本新糠虾性征出现时间无显著的影响,但对雄性日本新糠虾性成熟时间有不同程度的延迟作用,对照组性成熟时间为(25.71±0.76)d,而H组为(28.00±0.82)d,两组间差异显著(P0.05);雌性日本新糠虾的性成熟时间也有随组织胺质量浓度升高而呈延迟的趋势,但仅H组与对照组存在显著差异(P0.05),延迟近3d。经HPLC(High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)法检测日本新糠虾体内组织胺后,发现M和H组中检测出了较高含量的组织胺,分别达到(435.33±56.94)pg/g和(478.67±140.57)pg/g,显著高于对照组(P0.05)。上述结果说明,水体中一定质量浓度的组织胺能抑制日本新糠虾的生长和发育,其体内组织胺含量的升高可能是重要的诱因之一。     

同源和异源精子诱导大黄鱼(Pseudosciaena crocea)雌核发育的胚胎发育比较及子代 SSR 遗传标记分析

以紫外灭活的同源(大黄鱼)精子和未灭活的异源(鮸鱼)精子为激活源, 采用冷休克处理的方法诱导了大黄鱼雌核发育二倍体, 进行胚胎发育和 SSR 标记分析的比较研究。结果表明, 异源组的受精率和孵化率高于同源组, 但存活率低于同源组; 两组中经冷休克处理未能恢复倍性的胚胎发育畸形而陆续死亡, 恢复倍性的胚胎在发育程序上均与普通大黄鱼相同, 但各阶段出现时间较对照组滞后; SSR 分析显示同源组子代中有 16.7%出现父本条带, 异源组子代均未出现父本条带。以灭活的同源(大黄鱼)精子和未经灭活的