包埋脱水法超低温保存萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体的研究

以本实验室保存的萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体为材料,用包埋脱水法超低温保存萱藻丝状体,研究了蔗糖预培养浓度和时间、胶球含水量、化冻温度以及胶球恢复时间对萱藻丝状体存活率和冻存后生长发育能力的影响。结果显示:(1)萱藻丝状体胶球在0.4mol/L的蔗糖溶液中预培养6h能获得最高的存活率;(2)萱藻丝状体胶球的最佳含水量较低,为15%左右,当含水量高于27%时,冻存后的存活率为0;(3)40°C为最适的化冻温度;(4)化冻后,将萱藻丝状体胶球在黑暗条件下恢复18h能显著提高存活率;(5)在最佳条件下,萱藻丝状体经冻存后的存活率最高可达54.79%,恢复后的丝状体与冻存前丝状体并无区别,且经诱导后能够产生正常的孢子囊,放散的孢子可以发育成叶状体。     

环境因子对萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体孢子放散的影响

在实验室条件下,以本实验室保存的萱藻丝状体为材料,研究了温度(7—27℃),光照强度[18—126μmol/(m2.s)]和丝状体生物量(0.1—1.6mg/ml)对萱藻孢子放散的影响。结果显示:(1)温度为12℃最适宜萱藻孢子的放散,在此温度下,孢子放散量大,放散速度快;(2)光照强度对孢子的放散具有重要影响,72μmol/(m2.s)为刺激萱藻孢子放散的最佳光照条件;(3)萱藻丝状体生物量过低,则孢子放散量较小无法达到采苗要求,而过高亦会抑制孢子的放散,生物量为0.8mg/ml时最适宜孢子的放散。     

应用响应曲面法优化萱藻丝状体单室孢子囊发育条件

为优化萱藻丝状体单室孢子囊发育条件,提高孢子囊比例,研究以萱藻丝状体为材料,在单因素试验的基础上,应用响应曲面法对丝状体单室孢子囊的发育条件进行优化。结果显示,诱导萱藻丝状体单室孢子囊发育的最佳条件为:温度17.67°C,光照强度30.32μmol/(m²·s),外加氮浓度37.37 mg/L,外加磷浓度10.63 mg/L。在该条件下诱导培养20 d,丝状体孢子囊比例为48.92%±5.58%,约为对照组的1.41倍。试验结果与理论预测值的相对误差小于5%,模型可靠。为评价优化培养后萱藻丝状体孢子囊的发育情况,对丝状体进行了阴干刺激(17°C,2h),结果显示,优化培养后的丝状体游孢子放散量(3.33×10⁶ ind./g FW)约为对照组(1.67×10⁶ ind./g FW)的1.99倍。研究表明,在萱藻丝状体单室孢子囊诱导过程中,对诱导环境条件进行有目的性的调控,不仅可以提高孢子囊比例,还可以促进孢子囊发育和游孢子放散的同步性。     

环境因子对萱藻(Scytosiphon lomentaria) 孢子附着的影响

将实验室保存的萱藻丝状体经过扩增、诱导得到具有成熟孢子囊的丝状体作为实验材料, 在实验室条件下研究了光照强度[0—126?mol/(m2·s)]、温度(7—27℃)、盐度(8—56)、pH(6.7—9.7)对萱藻孢子附着的影响。结果表明: (1) 萱藻孢子附着的最适光照强度为54?mol/(m2·s), 在此光照强度下, 单位面积的孢子附着量最大; (2) 温度对萱藻孢子附着的影响显著, 19℃是萱藻孢子附着的最佳温度条件; (3) 盐度过低(≤24)或过高(≥40)都会造成孢子的死亡, 萱藻孢子附着的最适盐度为30; (4) 在设定的pH范围内, 当pH为8.2时, 最有利于萱藻孢子的附着。     

四种培养液对萱藻种质复壮的影响

本实验以2012年采自烟台海域的萱藻种质为材料,选取f/2、F1、MAV#3和ES 4种培养液,每种培养液分别设置4种浓度梯度对萱藻种质进行复壮,并与2015年(当年)的种质对比,研究不同种类和浓度的培养液对萱藻种质复壮的影响。本底实验使用1倍浓度的F1培养液,数据显示2012年萱藻种质存在退化现象,在培养第20d,复壮前的2012年和2015年萱藻种质增重倍比分别为29.91%和56.61%,培养第30d的孢子囊比例分别为10.48%和12.99%。培养液复壮实验的第20d和第30d分别计算增重倍比和孢子囊比例,结果显示:(1)1/4倍浓度的ES培养液最适于对萱藻种质进行复壮,复壮后的萱藻种质增重倍比提高至75.04%,同时孢子囊比例提高至14.43%;(2)1倍浓度的f/2培养液只适用于萱藻种质的丝状体生长,但不适于其孢子囊形成,复壮后的增重倍比为46.88%,孢子囊比例的为8.65%;(3)2倍浓度的F1培养液较适于对萱藻种质进行复壮,复壮后的增重倍比提高至30.58%,孢子囊比例提高至12.69%;(4)MAV#3不适用于萱藻种质的复壮,2倍浓度的MAV#3培养液复壮后的增重倍比和孢子囊比例分别降低为23.19%和7.84%。因此,1/4倍浓度ES培养液对萱藻种质的复壮效果最佳。     

NaHCO3浓度对塔胞藻、小球藻和新月菱形藻生长的影响

在温度为 ( 2 2± 1 )℃ ,盐度为 2 8的条件下 ,用不同浓度的NaHCO3( 0 ,1 0 0 ,2 0 0 ,40 0 ,80 0 ,1 2 0 0和 1 60 0mg/L)对青岛海洋大学微藻种质库保存的塔胞藻 (Pyramidomonassp.)、小球藻 (Chlorellaspp .)和新月菱形藻 (Nitzschiaclosterium )进行培养。实验结果表明 ,NaHCO3浓度对 3种海洋微藻生长的影响差异显著 ,经过 6d的培养 ,塔胞藻和小球藻的细胞浓度都在NaHCO3浓度为 1 2 0 0mg/L时达到最大值 ;新月菱形藻的细胞浓度在NaHCO3浓度为 40 0mg/L时达到最大值。     

基于正交实验的高含量藻红蛋白紫菜丝状藻体优化调控培养条件研究

丝状藻体在紫菜养殖的人工苗种生产中非常重要,在利用于分离提取高价值的藻红蛋白方面也具有潜在的利用价值。本研究采集了成熟紫菜叶状体的果孢子释放的初始丝状藻体,基于3因子3水平的正交实验设计方案[采用具有分析交互作用的正交表L₂₇(3¹³)],确定了丝状藻体藻红蛋白含量对环境因子的响应以及优化的调控培养条件。结果表明,温度、光照强度和盐度因子对丝状藻体藻红蛋白含量均有显著影响(P≤0.048 1),并且温度和光照强度或盐度因子间存在交互作用(P ≤0.043 1),但光照强度和盐度因子间的交互作用不显著(P=0.469 8)。获得的优化调控培养条件为:温度18 ℃、光强1 500 lx、盐度20或25。优化调控培养条件下的丝状藻体藻红蛋白含量高达64.73 mg/g.dw(平均值±标准偏差SD为58.24±5.07 mg/g.dw)。     

硝酸钠浓度对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)MACC/B226生长及脂肪酸组成的影响

在温度为22±1℃ ,盐度为28,硝酸钠浓度分别为75,375,750,1125,1500,1875mg/L的条件下 ,用F/2培养基对青岛海洋大学微藻种质库保存的三角褐指藻(Phaeodactylumtricor-nutum)MACC/B226进行培养 ,测定了生长及脂肪酸组成。实验结果表明 ,在硝酸钠浓度为1125mg/L时 ,三角褐指藻相对生长率最高。在75～375mg/L之间二十碳五稀酸 (EPA)含量随着硝酸钠浓度的增加而增加 ,在375～1875mg/L之间EPA含量变化不大 ,在1875mg/L时达到最高值 (占总脂肪酸的12.6% )。     

坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状藻体生长增殖的优化调控培养条件研究

丝状藻体是紫菜生活史中的重要阶段,其生长增殖与环境条件密切相关.本研究考察了与坛紫菜丝状藻体生长增殖相关的多个影响因子,探讨了可促进坛紫菜丝状藻体生长、达到生长速率快的优化调控培养条件.具体操作实施过程为：初始丝状藻体来自成熟紫菜叶状体的果孢子释放,基于8因子3水平的正交实验设计方案[采用正交表L27（313）],确定了丝状藻体生长对多个环境因子的响应以及优化的调控培养条件.结果表明,除开pH、复合维生素浓度和NaHCO3浓度外,其他因子对丝状藻体生长均有显著的影响（p≤0.043 8）.获得的优化调控培养条件为：温度18℃、光强27μmol/m2·s-1、盐度25、pH值8.5、复合维生素浓度15μg/dm3、NaHCO3浓度2 mg/dm3、每天光照时数18 h、营养液浓度为f培养介质.优化调控培养条件下的丝状藻体生长速率高达12.07%,平均值±标准偏差SD为（10.70±0.88）%/d.     

萱藻(Scytosiphon lomentaria)无菌种质获取技术研究

本研究将抗生素处理法与固体平板培养法相结合,对获取无菌萱藻种质的技术进行探索研究。萱藻种质首先经过匀浆机处理(50Hz,59s)、无菌海水冲洗过滤,然后在黑暗条件下,以抗生素混合液(头孢噻肟钠800μg/L、红霉素200μg/L、亚胺培南200μg/L、乙酰磺胺1600μg/L和制霉菌素16μg/L)处理7d,之后转移至固体平板培养后光照条件下培养形成藻落。经过固体培养平板、液体培养基及DAPI染色三种方式确认20个样品中有19个达到了无菌状态,成功率达95%。结果表明这种获取无菌萱藻种质的方法是成熟可靠的。     

龙须菜(Gracilariopsis)/江蓠(Gracilaria)的生长和种质特性分析

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是具有重要经济价值和生态效益的大型红藻, 主要用作琼胶提取原料和鲍的饵料。本研究利用生理生化、液相色谱-质谱联用和氨基酸分析等方法, 比较了龙须菜(Gp. lemaneiformis) (wt、981、Gl-1、Gl-s、Gl-g)、异枝龙须菜(Gp. heterocla, Gh)和细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata var. liu, Gt)的生长及藻胆蛋白、琼胶、红藻糖苷和氨基酸等的差异, 以期为龙须菜/江蓠栽培中的种质区分及选择提供参考。结果表明Gt在23 ℃和30 ℃条件下生长均最快, 其相对生长速率分别为野生型龙须菜(wt)的2.19倍和2.49倍。龙须菜Gl-s中藻胆蛋白浓度最高, 为wt的1.91倍。除了Gt之外, 其余6种藻中琼胶产率较高(16.22%~18.91%)。Gt中红藻糖苷和海藻糖积累最多, 分别为wt的3.50倍和1.81倍。Gl-g、Gl-s、Gt和Gh多糖丰富, 在36.89%~40.23%; 龙须菜981、Gl-1、wt和Gl-s总氨基酸浓度较高, 在152.35~161.32 mg·g^–1干质量之间, 并且981、Gl-1、Gl-s氨基酸评分较优。综合以上结果, 龙须菜981、Gl-1和Gl-s的藻胆蛋白、琼胶和氨基酸等均显著优于其他藻, 并且生长较快, 可用于琼胶、藻胆蛋白及多糖的提取或鲍的饵料; 而细基江蓠繁枝变种生长快、红藻糖苷和海藻糖丰富, 可大规模栽培用作鲍的饵料。该研究为丰富及开发利用中国大型海藻种质资源提供了重要的资料。     

刀鲚、凤鲚和湖鲚矢耳石的形态学比较研究

选取凤鲚(Coilia mystus)、湖鲚(Coilia nasus taihuensis)以及采自崇明、黄海和瓯江口3个水域的刀鲚(Coilia hasps)的矢耳石为对象,描述了这些鱼类耳石的形态特征,并进一步使用基于12组形态数据的框架测量进行了种间和种内比较和判别分析.结果表明耳石形态的差异种间较种内更为明显...     

缢蛏（Sinonovacula constricta）GST和HSP90基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达特征分析

克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长，分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明，Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp，含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码212个氨基酸，Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%；而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp，ORF为2 181 bp，编码726个氨基酸，其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现，Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达，两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05)，表明氨氮胁迫引起机体的应激反应，2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限，不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。     

糖原含量与糖原磷酸化酶基因(GPH)和己糖激酶基因(HK)的表达在福建牡蛎生殖周期中的相关性分析

Glycogen, a polymer of glucose, is an important means of storing energy. It is degraded by glycogen phosphorylase (GPH) and hexokinase (HK), glycogen phosphorylase, and hexokinase cDNAs (Ca-GPH andCa-H...     

副溶血弧菌攻毒过程中文蛤肝胰腺弧菌载量变化的分析

文蛤(Meretrixpetechialis)是我国一种重要的海水养殖贝类,其养殖过程中病害导致的规模性死亡时有发生,已有的工作证实致病性弧菌是导致文蛤大规模死亡最为常见的病原。在本研究中,我们通过浸泡感染实验模拟了文蛤在自然条件下的弧菌胁迫环境,明确了攻毒水体中弧菌生长变化规律;攻毒过程中宿主载菌量分析显示,文蛤肝胰腺组织弧菌载量在攻毒后呈第1天急剧上升,第3天迅速下降的变化趋势,而且不同个体间载菌量差异较大;通过不同弧菌含量攻毒实验,发现在攻毒早期文蛤体内弧菌载量与水体环境的弧菌含量之间呈显著的正相关(Spearman’sρ=0.899,P=0.000),而在感染中后期不同攻毒强度组之间无显著差异,且呈现较低水平,为0～205CFU/mg,预示着宿主免疫系统和肝胰腺微生物群落可将致病菌的数量控制在一定的范围。上述研究为开展文蛤感染发病过程中弧菌载量和免疫抗性评价相关研究提供了参考。     

斑节对虾TSG101基因的克隆及表达分析

为探究肿瘤易感基因101(简称TSG101)对斑节对虾(Penaeusmonodon)的免疫应答作用,了解在细菌刺激下斑节对虾的机体发生的变化机制,本研究以哈维弧菌(Vibrioharveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为实验组,以磷酸缓冲液(PBS)为对照组,通过荧光定量分析展开对斑节对虾对菌刺激的免疫应答作用。结果显示,斑节对虾的TSG101在各组织中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高。在金黄色葡萄球菌刺激下,斑节对虾的TSG101在肝胰腺中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第12小时的TSG101 mRNA的表达量达到最大(为对照组的21.60倍);在鳃中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第6小时斑节对虾TSG101的表达量达到最大值(为对照组的3.64倍)。在注射哈维弧菌第9小时,肝胰腺中的PmTSG101 mRNA表达量极显著上调(P0.01)且达到最大(为对照组的2.50倍)。实验结果初步表明,斑节TSG101参与斑节对虾的先天免疫反应,在金黄色葡萄球菌和哈维弧菌的刺激的情况下,该基因RNA水平的表达情况发生明显变化。     

河流弧菌对牙鲆表皮黏液黏附作用的研究

为了解河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附特性,采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌黏附作用的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地黏附于牙鲆表皮黏液,黏附量随菌浓度升高而增大并符合饱和黏附动力学:y=417.89ln(x)+691.57(R2=0.986);在30℃下黏附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4~30℃范围内黏附量随温度升高而增多,30℃时黏附量最大;pH值酸性较碱性黏附作用明显,pH为5时最强;NaCl浓度在0.5%~4.5%范围内,细菌黏附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异(P<0.05);Ca2+,Mg2+能显著加强河流弧菌的黏附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物能显著促进河流弧菌的黏附作用(P<0.05)。以上结果说明:河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附量较大,这有利于进一步感染、致病;河流弧菌的黏附作用受温度、pH值、阳离子、碳水化合物等多种环境因子的影响,较高的水温有利于河流弧菌的黏附,有利于疾病的发生。     

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染卵形鲳鲹的病理学观察

病原菌美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. piscicida)分离自发病的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus), 本实验利用腹腔注射和浸泡的感染途径, 观察卵形鲳鲹发光杆菌病的病理变化。感染发病鱼呈现急性和慢性临床症状, 主要急性症状为鳃盖周围轻微出血, 腹腔积水和内脏器官多灶性坏死; 主要慢性症状为脾脏、肾脏和心脏内能观察到直径为0.5~1.0 mm 的白色粟米样结节; 利用光学显微镜和透射电镜观察的组织病理显示: 急性病理症状主要表现为鳃、肝和肾发生变性及凝固性坏死, 肾管微绒毛紊乱, 线粒体的嵴脱落, 脾淋巴细胞增生, 核染色质边集, 心肌细胞发生多灶性坏死,线粒体增生, 肠道的病变较轻微。慢性病理症状主要表现为鳃丝上皮细胞坏死, 脾淋巴细胞线粒体、高尔基体和内质网溶解, 肾小管上皮细胞的微绒毛脱落, 心肌纤维Z 带排列紊乱, 线粒体变性, 肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肠道出现典型的肉芽肿病变。相比之下, 脾脏、肾脏和心脏的病变是所有器官中最严重的。     

牙鲆耐寒相关基因CIRP、HMGB1的克隆及表达特征分析

为鲆鲽鱼耐低温标记辅助育种研究和应用提供候选基因,并了解耐寒相关基因在低温下的表达图示,作者通过同源克隆以及5?/3?RACE的方法扩增得到了牙鲆(Paralichthys olivaceus)CIRP和HMGB1基因。组织表达谱分析显示,这两个基因在脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、肠等组织均有表达,但HMGB1基因在鳃中表达较弱。低温胁迫后,两基因随着胁迫时间的延长其表达量在肌肉中都出现先上升后下降的趋势:在0~12 h逐渐上升并达到最大值,然后下降恢复至最初水平。但在肝脏和脑组织中的变化趋势却不同,低温胁迫后0~2 h HMGB1基因在脑中的表达量上升至最高,然后下降至最初水平,在肝脏中变化不大。而CIRP基因在低温胁迫后0~2 h在肝脏中表达量处于上升趋势,然后下降至初始水平,在脑中变化不大。由此推测,这两个基因在低温条件下都参与了机体对外界的抵抗,特别是在抵抗外界寒冷的主要组织—肌肉中发挥作用,可能共同参与了机体的免疫反应,对低温胁迫环境下的鱼体进行保护,可以作为鱼类耐低温标记筛选的候选基因。     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。