4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

海水养殖真鲷弧菌病病原菌外毒素的分离、纯化及生物学活性

1996年6月初，对福建省平潭县真鲷网箱养殖场发生的弧菌病进行研究，并确定该病病原菌为最小弧菌（Vibrio mimicus）。采用硫酸铵沉淀、DEAE－纤维素层析及Sephadex-G100层析等方法对最小弧菌产生的外毒素进行研究。结果表明，该外毒素为单一的多肽，分子量为30．456kD，对真鲷的LD50为4．48μg，对真鲷等养殖动物的溶血性最强，对Vero细胞的CD50值为0．48μg，肠毒性弱阳性。该外毒素与最小弧菌产生的其他毒力因子相比，性质独特，是一类新的毒力因子，建议命名为Vm-Pm毒素。     

一株副溶血弧菌D3112致病性和抗药性的表征

副溶血弧菌广泛分布于海洋环境中,虽然大多数环境菌株并非致病菌,但它们常常携有毒力基因,从而具有潜在的致病性。本文从黄海(山东青岛)海水中分离到一株副溶血弧菌D3112,对其进行了全基因组测序、溶血实验和人工感染实验等。基因组测序分析发现D3112并不含有副溶血弧菌的致病性标志溶血素基因tdh和trh,这与PCR检测结果一致,但含有其他溶血素基因以及多种毒力相关基因。生物学实验显示,该菌可产生明显的溶血现象,而且具有蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性,但是缺少卵磷脂酶活性。人工感染实验表明副溶血弧菌D3112具有致病性,感染斑马鱼的半致死剂量约为5×105CFU。药物敏感实验证明了D3112具有多重耐药性。本文对海洋环境中的副溶血弧菌D3112同时开展了基因型和表型研究,为准确评价环境细菌的潜在致病性提供了有用的数据信息。     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

鱼类病原鳗弧菌致病相关因子及分子生物学

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原,其流行区域广泛,能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其它养殖动物发生弧菌病,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关,包括由质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶等。本文论述了鳗弧菌的主要致病性相关因子及研究进     

凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)研究进展

自2009年以来,一种新兴的虾类疾病－急性肝胰脏坏死病(AHPND),对全球对虾养殖业造成了巨大的损失。已有研究表明,该病病原是一类含有特殊毒力因子的弧菌,主要是副溶血性弧菌(VPAHPND)。本文将从该病的发生与流行、病原、检测方法、防控措施等方面的最新研究成果进行阶段性的总结,以期为该病症的防控技术提供参考。     

对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)流行病学、诊断方法及防控措施的研究进展

自2009年以来,一种新兴的虾类疾病——急性肝胰腺坏死病(AHPND),对全球对虾养殖业造成了巨大的损失。已有研究表明,该病病原是一类含有特殊毒力因子的弧菌,主要是副溶血性弧菌(VPAHPND)。根据已发表的文献对该病的发生、流行、病症、病原、检测方法和防控措施等方面进行阶段性的总结,以期为该病症的防控技术提供参考。     

南麂岛海洋沉积物中抗大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病弧菌的放线菌分离和筛选研究

采用平板涂布法从南麂岛近海海洋沉积物样品中分得86株放线菌,用琼脂块法和杯碟法结合筛选出对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)两种大黄鱼病原性弧菌具有不同拮抗作用的海洋放线菌5株,其中编号NJR0956的菌株对两种致病菌的抑菌圈直径均25mm,表现出较强的抑制作用;进而测定了5株活性菌株的抗菌谱。结果表明,它们对指示菌中的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)四种病原弧菌均具有较好的拮抗作用;在对NJR0956的抑菌效果研究中发现,该菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中不仅能够增殖,而且能够有效地抑制病原菌的生长。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。     

几种海洋弧菌的密度感应系统及其信号干扰

密度感应(quorun sensing，QS)是细菌通过感受种群密度的变化而控制特定基因表达的一种机制(Miller et al.,2001)。密度感应细菌可以产生和释放特定的化学信号分子,称为自诱导分子(autoinducer，AI)，其浓度随着细菌密度的增加而增加。当少量细菌分泌的自诱导分子进入环境后,由于其浓度太低而无法被细菌中的受体蛋白检测到；但是,当细菌达到一定密度后,自诱导分子的浓度超过一定的阈值.受体蛋白与自诱导分子结合,并将此信号传导到细胞内,特异性地调控特定基因的表达。迄今为止的研究表明,许多细菌都可分泌化学信号分子来协调种群的活动，这些化学信号的种类是多种多样的,而且同一种细菌可以利用多种化学信号和复杂的调节环路来进行通讯。细菌种内和种间的通讯对细菌的存活及与自然生境之间的相互作用至关重要(Miller et al.,2001) 迄今为止研究的密度感应系统主要可分为3类:一类以酰基高丝氨酸内脂(acylated homoserine lactoes，AHL)为自诱导分子,如:费氏弧菌(Vibrio fischeri);一类以多肽为自诱导分子,如:革兰氏阳性细菌;一类是以哈维氏弧菌(V. harveyi)为代表的密度感应系统。在系统中有3种类型的信号分子( Miller et al.2001; Defoirdt et al.2004,Henke et al,2004)作者将着重介绍与海洋弧菌的密度感应系统、信号干扰及其应用相关的研究成果,为今后进一步的研究提供依据。     

海洋微藻培育系统抗弧菌作用机理

于1996年1－6月在中国科学院海洋研究所对微藻培育系统抗弧菌作用机理进行研究。结果表明，球等鞭金藻3011、三角褐指藻2038、扁藻1040及小球藻1061等4种饵料微藻中与藻共存细菌单菌株及群落均无限制弧菌生长作用；各培养时期除菌微藻3011不能限制弧菌生长；除菌微藻2038具有微弱限制弧菌生长能力，处于生长指数后期时作用相对较强，与藻共存细菌群落回加除菌微藻3011及2038，则恢复排斥弧菌能力，细菌先于弧菌加入时（如先加入3d)排斥能力显现较快，反之则较慢。另外还发现，除菌藻2038代谢产物（0．65μm 滤膜过滤获得）无限制弧菌生长能力，4种饵料微藻（自然藻－菌混和体）代谢产物（0．2及0．65μm滤膜过滤获得）无限制弧菌生长作用。因此，微藻培育系统抗弧菌机理可归结为：以微藻为基础的微小生物群落因优先占有生态空间而对弧菌菌群具有排它性。     

九孔鲍肠道及其养殖水体中弧菌抗药性的研究

为更好地防治鲍鱼病害的发生和流行,我们对分离自广东汕尾粤顺鲍鱼养殖场九孔鲍肠道及其养殖水体的弧菌菌株的耐药性进行了研究。对所分离鉴定的菌株进行了16种抗生素药物敏感性试验。结果表明,对绝大多数分离的菌株,四环素、青霉素G、卡那霉素、丁胺卡那霉素和新生霉素都不敏感或无作用,氟哌酸、红霉素、氯霉素以及环丙沙星等则均比较敏感：复方新诺明、链霉素和多粘霉素B对所有所实验的菌株均有作用。     

深圳海域弧菌种类组成、数量分布及其与环境因子的关系研究

研究了深圳海域2008年4月、9月的水体弧菌数量、种类组成及其分布,探讨了弧菌总数及各优势类群的数量分布与环境因子间的相关关系。结果表明:弧菌总数分布具有季节性,东部海域春季(4月)的弧菌数量高于秋季(9月)的,其均值分别为1.50×10⁴ ,8.89×10² CFU/cm³;在西部海域秋季的略高于春季的,其均值分别为5.09×10²,2.66×10² CFU/cm³;弧菌数量最高值出现在大亚湾(4.40×10⁴ CFU/cm³)。弧菌的优势类群具有季节性分布特征:春季特有的优势类群有Vibrio gigantis类似种和V. splendidus类似种,秋季特有的优势类群有V. natriegens类似种;V. alginolyticus类似种是两个季节共有的优势类群,其数量春季高于秋季的。弧菌种类、数量与海水温度、盐度及细菌总数、Chl-a等环境因子有一定的相关性,其中盐度为弧菌种类及数量分布的主要影响因子。     

深圳海域弧菌种类组成、数量分布及其与环境因子的关系研究

研究了深圳海域2008年4月、9月的水体弧菌数量、种类组成及其分布,探讨了弧菌总数及各优势类群的数量分布与环境因子间的相关关系。结果表明:弧菌总数分布具有季节性,东部海域春季(4月)的弧菌数量高于秋季(9月)的,其均值分别为1.50×104,8.89×102CFU/cm3;在西部海域秋季的略高于春季的,其均值分别为5.09×102,2.66×102CFU/cm3;弧菌数量最高值出现在大亚湾(4.40×104CFU/cm3)。弧菌的优势类群具有季节性分布特征:春季特有的优势类群有Vibrio gigantis类似种和V.splendidus类似种,秋季特有的优势类群有V.natriegens类似种;V.alginolyticus类似种是两个季节共有的优势类群,其数量春季高于秋季的。弧菌种类、数量与海水温度、盐度及细菌总数、Chl-a等环境因子有一定的相关性,其中盐度为弧菌种类及数量分布的主要影响因子。     

致病性海洋弧菌对氨基糖苷类药物的耐药传递机制初步研究

随着抗菌药物在水产养殖中用量的增加及混合使用现象的出现，水产病原菌表现出更强的耐药性甚至是多重耐药性，大大增加了水产养殖中细菌性病害防治的难度。细菌耐药性最常见的传递方式是耐药质粒的转移。本研究通过对多个水产致病弧菌质粒上新霉素及卡那霉素的耐药基因aph（3''）-IIa进行检测分析，并利用电穿孔法将筛选得到的3个受试菌株上的质粒分别转入大肠杆菌中，结果从3个转化子中检测到目的基因。进一步的药敏测试结果显示，3个转化子的最小抑菌浓度（MIC值）以及最小杀菌浓度（MBC值）均明显上升。可见，在特定条件下，水生致病性弧菌对氨基糖苷类（新霉素和卡那霉素）的耐药质粒可转移至大肠杆菌并参与介导其耐药性，大大降低了受体菌对新霉素和卡那霉素的敏感性。本研究将为环境弧菌与临床细菌对氨基糖苷类药物的抗性传递研究提供数据基础和参考依据。     

一株生防细菌LHB02的筛选、鉴定及其发酵条件优化(英文)

从中国福建沿海某一污染滩涂的沉积物中筛选到一株具有较强拮抗水产病原菌的生防细菌LHB02。采用通用引物,对LHB02的16SrRNA片段进行扩增,获得1511bp的DNA系列,基于该DNA系列,结合细菌形态学、生理生化特征,鉴定LHB02为一株枯草芽孢杆菌。对LHB02进行了抗菌试验、抗菌谱检测和发酵条件优化研究,结果表明,LHB02对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等有很强的拮抗作用,其优化后的发酵条件为:KB培养基(蛋白胨20g,丙三醇10mL,K2HPO41.5g,MgSO4.7H2O1.5g,H2O1000mL);温度28°C,pH值7.0,培养时间36h,接种量1.5%。     

患病与健康杂色鲍苗中弧菌胞外产物的比较分析

本实验室于2004年采样自广东深圳下沙鲍鱼场变白掉板杂色鲍苗以及官湖养殖场健康鲍苗,各分离到16和34株弧菌,并对其胞外产物进行了比较分析。结果表明,官湖场健康鲍苗弧菌与下沙场患病鲍苗弧菌相比,前者20.59%(7株)菌株虽不分泌胞外酶但具溶血活性,余之菌株(64.71%,22株)或分泌酶和/或具溶血活性,但同时兼具蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶、脂肪酶和溶血活性的极少(5.88%,2株);后者则所有菌株均分泌胞外酶和/或具溶血活性,25.00%(4株)菌株能分泌四种酶及具溶血毒性,其余菌株(68.75%,11株)可分泌多种酶和/或具溶血活性。结果揭示,下沙鲍鱼场患病鲍苗弧菌分泌胞外酶和具溶血活性的能力明显强于官湖场健康鲍苗弧菌的,同时认为菌株X99-2和X100-8与下沙鲍苗病害潜在相关。     

两种微藻对凡纳滨对虾养殖环境中细菌数量变化的影响

往凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)养殖水体中引入波吉卵囊藻(Oocystisbor gei)和微绿球藻(Nannochlorisoculata),检测对虾养殖水体及虾体中异养菌和弧菌数量的变化,研究这两种微藻对对虾养殖环境细菌数量变化的影响.结果表明:引入波吉卵囊藻和微绿球藻能有效地抑制异养菌和弧菌的生长.实验组中养殖水体、凡纳滨对虾肌肉及肝胰脏中的异养菌和弧菌的数量都比对照组明显降低,特别是肝胰脏中弧菌数量在实验后期比前期降低了两个数量级;波吉卵囊藻实验组的抗弧菌作用最强.由此可见,采用选择优良藻种进行微藻生态调控对防治对虾疾病有着重要作用.     

虾夷扇贝育苗阶段幼体细菌性病原的确定

本研究确定了獐子岛集团虾夷扇贝Patinopecten yessoensis育苗过程中幼体大规模死亡的病原菌。采用TCBS培养基从患病幼体中分离弧菌,其数量为1.12×10⁴ CFU/g,以V1菌株和V2菌株为优势菌,占总弧菌数的64.3%和32.1%。用血琼脂平板测定V1菌株和V2菌株的溶血性,2株菌分别呈β溶血和α溶血。用2株菌分别感染扇贝幼体,幼体的死亡率显著高于对照组(P<0.05),症状与自然状态下的发病症状一致,并且从感染死亡的幼体中分离到原感染菌株,确定V1菌株和V2菌株是造成扇贝幼体大规模死亡的病原菌。对2株病原菌进行致病基因分析,结果发现V1菌株含有胞外金属蛋白酶基因。经16S rRNA基因测序分析,V1菌株(GenBank登录号KR232924)和V2菌株(GenBank登录号KR232925)与Vibrio splendidus ctt 31/5 和 Vibrio tasmaniensis 007的相似度分别为99.9%和99.2%。用药敏纸片扩散法检测病原菌对常见抗生素的敏感性,结果表明利福平、氟苯尼考和磺胺异恶唑均能有效抑制病原菌的生长。