一株海洋芽孢杆菌B09的筛选及其发酵条件优化研究

从海水养殖环境中筛选出一株具有较强抗菌活性的芽孢杆菌B09,并对其进行抗菌活性研究和发酵条件优化。结果显示B09对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鳗弧菌等致病菌有较强抑制作用,其最佳发酵条件如下:KB培养基(蛋白胨20g,甘油10mL,K2HPO41.5g,MgSO4.7H2O1.5g,水1000mL),发酵温度32℃,发酵起始pH为7,发酵时间48h,250mL的三角瓶装量100mL,接种量1%。     

海洋源生防细菌LHB02的筛选、鉴定及其抑菌谱检测

从高度污染的海滩污泥中,分离得到一株对部分水产病原菌有很强拮抗作用的生防细菌LHB02。采用细菌的通用引物进行LHB02的16SrRNA基因片段扩增,得到l511bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在进化位置上最为接近,结合传统的形态学、生理生化鉴定手段,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌...     

一株海洋拮抗菌D-2的筛选及其发酵条件初探

从西沙海域水样中分离了72株细菌,以副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus13150为病原指示菌,筛选到1株具有较好拮抗作用的海洋细菌,经形态观察、生理生化和16Sr DNA测序鉴定为居幼虫普罗威登斯菌(Providencia vermicola),编号为D-2,此菌在NCBI的登录号为KJ660957。同时,通过卤虫浸泡实验和药敏试验检测该菌的安全性,并初步优化其发酵条件。结果表明,D-2对杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌等有拮抗作用;其对卤虫的72 h半致死浓度(LC50)为108CFU/m L,而副溶血弧菌V.parahaemolyticus对卤虫的72 h LC50为105CFU/m L;此外,药敏试验说明该菌只对20种常规抗生素中的卡那霉素、诺氟沙星2种产生抗性,其余的18种抗生素表现敏感性;优化后的发酵条件为:温度25℃~37℃,p H 7.0,盐度4%。该菌作为一种新的益生菌,有望应用于海水养殖病害控制。     

大黄鱼病原弧菌拮抗菌筛选

用平板涂布法从集美海边分离到381株细菌,用平板划线法或点种法检验这些海洋细菌对两株病原弧菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的拮抗作用。从中挑选2株对海水养殖动物病原弧菌有较好拮抗作用的细菌,编号为GX75和GZ46。对拮抗菌(GX75和GZ46进行了抗菌谱测定,结果表明,GX75对9株指示菌中的副溶血弧菌、河流弧菌和坎普氏弧菌有较好的拮抗作用,GZ46对副溶血弧菌、溶藻弧菌和坎普氏弧菌有较好的桔抗作用。在营养肉汤中,测定了GX75和GZ46的抗菌作用,表明(GX75和GZ46对副溶血弧菌拮抗作用很明显。     

弧菌拮抗菌的筛选

用平板划线或点种法对 6 0 2株海洋细菌进行筛选 ,得到 4株对海水养殖动物 (鱼、虾、贝 )的病原菌有拮抗作用的细菌。并对拮抗菌 QJ2的拮抗作用进行了研究 ,结果为 :QJ2有广泛的弧菌抗菌谱 ,对 37株弧菌的抗菌阳性率达到 89.2 % (33/ 37) ;用活菌平板计数法和 O.D.60 0 nm研究了QJ2培养物的去细胞上清液 (CFS)与病原菌 W- 1的作用动力学 ,15min时 W- 1的细菌数便开始减少 ,4 h时细菌数最少 ,6 h后开始增加 ,而对照组的细菌数呈逐渐上升趋势 ;QJ2对自身的拮抗物质不敏感 ;QJ2抗性物质的分子量不大于 80 0 0 Da;经常规生理生化方法和 API- 2 0细菌快速鉴定系统鉴定 ,QJ2为气味黄杆菌 (Flavobacterium odoratum)。     

一株海洋生境芽孢杆菌FA08的筛选、鉴定及其酶学特性和抗菌性能分析

利用生防细菌拮抗病原菌,是水产疾病防治的有效措施之一。本研究从福建省宁德市海水养殖区底泥筛选到一株既能产纤维素酶又具有拮抗水产病原菌功能的芽孢杆菌FA08,通过传统的形态学、生理生化鉴定手段,并结合16S r DNA序列分析,鉴定功能菌FA08为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,Gen Bank登录号:KM892857)。进一步考察功能菌FA08菌株所产的纤维素酶对p H值、温度和紫外线的敏感性发现,功能菌FA08所产纤维素酶对酸碱度具有很强的耐受力,p H 3至p H 10范围内保持稳定,对温度也有较好的稳定性,在30—80°C范围内,其酶活仍达到70%,对紫外线不敏感。对FA08的抗菌性能进行分析,结果发现,功能菌FA08发酵上清对嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌有拮抗效果。因此,该菌对未来水产业具有良好的开发应用价值。     

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵培养基优化的研究

采用单因素试验和正交试验,对从山东东营海岸湿地盐碱滩地土壤中筛选出的一株海洋菌种———粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的发酵培养基进行优化,并进行100 L发酵罐中试放大试验的研究。确定粘质沙雷氏菌的最佳培养基配方为葡萄糖10 g/L,硫酸铵5 g/L,麸皮50 g/L,柠檬酸三钠1.0 g/L,K2HPO4.3H2O 0.3 g/L,FeSO4.7H2O 0.05 g/L,MgSO4.7H2O 0.5 g/L,pH 7.2~7.7。发酵最适温度为30℃。通过测定粘质沙雷氏菌在发酵罐中培养的生长曲线,确定发酵时间以28~30 h为宜,发酵结束后发酵液中的活菌数约为50×108个/mL。将所筛选到的粘质沙雷氏菌应用于农作物的病害防治,效果非常显著,表明是一株高活性的生物防治拮抗菌。此研究结果为高效率、低成本和工业化生产具有生物防治作用的海洋菌种制剂提供了科学依据,也为海岸湿地盐碱土的可持续开发利用提供了技术支撑。     

生防细菌K2-1对大菱鲆病原菌的抑制作用及其抗菌特性分析

为探讨生防细菌应用于水产养殖动物细菌病防治的可行性,作者从厦门市海沧港口污泥中筛选到一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)K2-1,利用琼脂扩散法发现其发酵上清对大菱鲆(Scophthalmus maximus)养殖常见致病菌——副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus))有较强拮抗作用。进一步分析抗菌物质的部分特性,结果显示,蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)K2-1发酵产生的抗菌物质含有蛋白(肽)类成分,该抗菌物质具有一定的耐热性,其在温度40~70℃的条件下保持较好的抑菌效果,对酸碱度也有很强的耐受力,pH在3.0~9.0范围内,活性降低少于15%,对紫外线不敏感,对胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶也不敏感,但对蛋白酶K敏感。从实验结果可以初步确定该菌具有较好的开发价值。     

一株拮抗菌C-5 的分离及鉴定

针对目前海参养殖中水产微生态制剂品种单一、施用效果不稳定等现状,作者从地瓜参(Acaudina molpadioidea)肠道分离土著肠杆菌(Enterobacter),筛选到1株具有较好拮抗作用的海洋细菌C-5,该菌对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)等7种细菌有拮抗作用;通过形态观察、生理生化和16S rDNA基因序列分析鉴定为霍肠杆菌(Enterobacter hormaechei);通过卤虫(Artemia)和药敏实验检测该菌具有安全性,其对卤虫的72 h半致死浓度(LC50)为108cfu/m L,只对20种常规抗生素中的5种产生耐药性;对C-5的发酵条件进行优化,该菌优化后的发酵条件为:温度30℃,pH 7.0,盐度2%。结果表明,C-5有望作为一种益生菌应用于海水养殖病害控制。     

海洋放线菌对大黄鱼病原弧菌的拮抗作用和抗菌谱

在大黄鱼（Pseudosciaena crocea)病原弧菌的拮抗放线菌筛选和人工诱变基础上，选择出对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌（V.paradaemolyticus)同时具有较强拮抗作用的4株放线菌，采用琼脂块法测定4株放线菌的抗菌谱，并检测4株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用，结果表明：4株放线菌的抗菌谱均较窄，在固体和液体培养基中对2种病原弧菌都有较强的拮抗作用。     

Identification of a marine agarolytic bacterium Agarivorans albus QM38 and cloning and sequencing its beta-agarase genes

A total of 117 agar-decomposing cultures were isolated from coastal seawater around Qingdao,China.The phenotypic and agarolytic features of an agarolytic isolate,QM38,were investigated.The strain was gram negative,strictly aerobic,curved rod and polar flagellum.On the basis of several phenotypic characters,biochemical and morphological characters and phylogenetic analysis of the gene coding for the 16S rRNA,the strain was identified as Agarivorans albus strain QM38.This strain can liquefy the agar on the solid agar plate.An excellular agarase activity was determined in liquid culture.The enzyme exhibited maximal activity at 40℃,pH 7.6.Its activity was greatly affected by different concentrations of agarose.The highest activity 32 U/ml was achieved in the culture supernatant.The hydrolytic product was analyzed by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE).After complete hydrolysis of agarose,a series of agaro-oligosaccharides were produced.The main products of the enzymes were oligosaccharides in the degree of polymerization (DP) of 2,4,6 and 8.Three genes agaD01,agaD02 and agaD03,encoding β-agarases,had been cloned from genomic DNA of Agarivorans albus strain QM38.The open reading frame of agaD01,consisted of 2 988 bp,and shared 95.5%-98.9% identity to the β-agarase genes of some strains of Vibrio and Agarivorans.Gene agaD02 comprised 2 868 bp and encoded a 955-amino-acid protein.It showed 97.4% and 98.7% identity to the β-agarase genes of strain Vibrio sp.PO-303 and strain Vibrio sp.JT0107,respectively.Only partial sequence of agaD03 gene has been cloned.It showed 96.5% identity to β-agarase gene (agaB) of Pseudoalteromonas sp.CY24,and shared 96.8% identity to β-agarase-c gene of Vibrio sp.PO-303.     

牙鲆肠道内弧菌拮抗菌的分离与筛选

根据微生态学原理,用普通培养基和选择性培养基相结合的方法,分离健康牙鲆肠道内的固有菌群。对获得的菌株进行弧菌的抑制试验,以筛选弧菌拮抗菌。用点种法初步筛选出6株对致病性弧菌有不同抑制作用的拮抗细菌（G12,G13,G14,G15,G16,Y1-13）。进一步研究它们的抑菌活性,在上清液抑菌试验中,G12,G13,G14,G15,G16这5株菌均未表现出抑菌作用,表明它们的抑菌活性较弱,而且受环境条件的影响。在Y1-13和弧菌混合培养实验中,弧菌的数量均明显低于对照组弧菌的数量,表明Y1-13对弧菌具有较强的抑制作用,有望通过生物学和鱼体保护等方面的研究,将其制成微生态制剂应用于牙鲆的养殖。     

红树林来源白浅灰链霉菌中生物碱类次级代谢产物研究及核糖体工程优化

综合应用Sephadex LH-20柱层析、反相中压液相柱层析、正相硅胶柱层析等方法对白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)MGR072的生物碱类次级代谢产物的化学成分进行色谱分离,并运用紫外吸收、核磁及质谱等波谱方法对结构进行解析和鉴定,确定了两个化合物结构,分别为2-喹啉酸酯和4(1H)喹唑酮;基于核糖体工程原理,对该野生型菌株进行抗链霉素和抗利福霉素突变株筛选,得到1765株抗性突变株,其中S1、S2、S3、S4、R1、R2这6株的目标产物产量发生不同程度的变化,突变株R1、S3、S4相应峰的积分面积高达野生型菌株(WT)的15、24和12倍;突变株R2的相应峰几乎中断消失.本研究显示针对红树林微生物中丰富的生物碱类次级代谢产物,可通过定向化学分离和核糖体工程优化,快速锁定其中微量的新颖结构类群并对其产量进行调控,为后续分离新天然产物打下基础.     

海洋真菌Neosartorya fischeri 1008F1的次级代谢产物抑菌及抗肿瘤活性的研究

通过抑菌及抗肿瘤活性实验,明确海洋真菌Neosartorya fischeri 1008F1次级代谢产物中的活性有效组分。应用对峙培养法和生长速率法,对菌株的抑菌活性进行测定。应用MTT法,对菌株的抗肿瘤活性进行测定。应用凝胶(Sephadex LH-20)柱层析的方法,对菌株发酵产物的提取物进行分离。结果发现,海洋真菌Neosartorya fischeri 1008F1的水溶性提取物对番茄早疫菌(Alternaria solani)具有一定的抑制活性。菌株的粗提物浸膏经Sephadex LH-20柱梯度洗脱后,得到的组分B、C、D、E和F。在0.5 g/L的供试浓度下,组分B、C和D对胃癌细胞SGC-7901的抑制率均高于80%,而组分B、C、D、E和F对肝癌细胞BEL-7404的抑制率均高于70%。     

海洋放线菌胞外多糖发酵工艺及其条件研究

以具有明显海洋特性的、产胞外免疫活性多糖的链霉菌2305菌株作为发酵菌种，对其胞外多糖的发酵工艺及其条件进行了研究，考察了不同碳源、氮源、水质、培养基初始pH值、发酵温度、通气量等因素对发酵菌种的生物量及胞外多糖产量等的影响，建立和优化了胞外多糖摇瓶发酵培养基配方、发酵工艺及发酵条件，胞外多糖产量达到4．58g／L，转化率达到6．90％。研究了发酵过程中菌体生物量、底物糖残余量、pH值、产物多糖积累量等的动态变化，分析讨论了2305菌株胞外多糖发酵的动力学类型。     

绿潮藻浒苔微生物高效降解及生物乙醇制备

从绿潮藻暴发海域的底泥和腐烂浒苔(Ulva prolifera)中,筛选出一株可高效降解浒苔纤维素的微生物菌株(F菌株),通过刚果红染色实验以及真菌的ITS分析,鉴定为曲霉属真菌。以浒苔为诱导培养基制备F菌株的粗酶液,测得其滤纸纤维素酶活为34.79 U/m L。在发酵实验中,当酶解条件为6%的粗酶液添加量、反应温度为38℃、反应时间为60 h、pH为6.8时,浒苔纤维素降解效果最好,酶解液发酵乙醇产量最高达到28.98 g/L。     

福鼎海域坛紫菜叶状体体表外生细菌的组成和数量分析

从采集自福鼎敏灶湾和硖门湾海域的健康坛紫菜（Porphyra haitanensis）叶状体体表分离、纯化到26株外生细菌．根据细菌菌落特征、菌体形态和16SrDNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定,将其确认为6种不同的菌属,分别是假交替单胞菌属（Pseudoaheromonas）、Aquimarinas属、交替单胞菌属（Aheromonas）、黄杆菌属（Flavobacteriums）、弧菌属（Vibrio）和嗜琼胶菌属（Agarivorans）．2个海湾坛紫菜叶状体体表外生菌群数量稳定且差别不大,外生细菌菌属组成基本相同,个别菌属稍有差异,优势菌属为假交替单胞菌属和Aquimarinas属,常见菌属为交替单胞菌属和黄杆菌属,少见菌属为弧菌属．敏灶湾坛紫菜体表外生菌群数量为（5．7～6．5）×10^4cfu／g,外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占38．5％,Aquimarinas属占52．8％,交替单胞菌属占13．9％,黄杆菌属占11．5％,弧菌属占3．3％．硖门湾坛紫菜体表外生菌群数量为（6．4～7．6）×10^4cfu／g,外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占37．3％,Aquimarinas属占32．0％,交替单胞菌属占14．0％,黄杆菌属占12．7％,弧菌属占2．7％,嗜琼胶菌属占1．3％．优势和常见菌属菌株对健康坛紫菜叶状体进行感染,发现这些菌株对坛紫菜叶状体无致病力,叶状体生长无异常．这些可为坛紫菜微生物学研究提供基础资料．     

坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状藻体生长增殖的优化调控培养条件研究

丝状藻体是紫菜生活史中的重要阶段,其生长增殖与环境条件密切相关.本研究考察了与坛紫菜丝状藻体生长增殖相关的多个影响因子,探讨了可促进坛紫菜丝状藻体生长、达到生长速率快的优化调控培养条件.具体操作实施过程为：初始丝状藻体来自成熟紫菜叶状体的果孢子释放,基于8因子3水平的正交实验设计方案[采用正交表L27（313）],确定了丝状藻体生长对多个环境因子的响应以及优化的调控培养条件.结果表明,除开pH、复合维生素浓度和NaHCO3浓度外,其他因子对丝状藻体生长均有显著的影响（p≤0.043 8）.获得的优化调控培养条件为：温度18℃、光强27μmol/m2·s-1、盐度25、pH值8.5、复合维生素浓度15μg/dm3、NaHCO3浓度2 mg/dm3、每天光照时数18 h、营养液浓度为f培养介质.优化调控培养条件下的丝状藻体生长速率高达12.07%,平均值±标准偏差SD为（10.70±0.88）%/d.     

摄食紫菜粉等4种单一饵料的蚤状潘脂肪酸组成的比较

用GC／MS法分析比较了紫菜粉、小球藻、酵母、Banta液（牛粪1．5g＋干稻草2g＋沃土20g＋水1000cm3）4种食物条件下蚤状潘的脂肪酸组成．结果表明：4种食物培养下,蚤状潘的总脂含量依次为39．80、60．10、44．60、52．30mg／g．一共检测出脂肪酸14种,其中8种饱和脂肪酸（SFA）,2种单不饱和脂肪酸（MUFA）,4种多不饱和脂肪酸（PUFA）．紫菜粉培养组与小球藻组PUFA含量显著高于酵母组和Banta液组（P〈0．05）,占总脂肪酸的1／3以上,酵母组MUFA质量分数最高（P〈0．05）,达55．73％,Banta液组以SFA质量分数最高（P〈0．05）,为52．45％．其中紫菜粉组的PUFA中缺乏C18：3,但C20：5（EPA）和C20：4（AA）质量分数高达22．67％和9．02％是小球藻组的1．6倍和4．5倍（P〈0．05）,而且EPA和AA的实际含量也显著高于小球藻组（P〈0．05）,达到9．02mg／g和3．59mg／g;比较得出,紫菜粉培养组的20碳以上必需不饱和脂肪酸含量丰富,明显高于其他3组．本实验证实蚤状潘的脂肪酸组成与食物脂肪酸成正相关．分析认为,用紫菜粉培养枝角类用于海水育苗会取得更佳的营养效果．     

Effect of salinity on the growth, biological activity and secondary metabolites of some marine fungi

The study investigated the effects of salinity on growth,antimicrobial activities and secondary metabolites of 47 marine filamentous fungi isolated from the East China Sea near the western shore of the Taiwan Straits.The results indicate that NaCl promoted the growth up to 91.5% of test strains.However,only 14.9% of them showed a significant increase of antimicrobial activity against Candida albicans.When incubated in different concentrations of NaCl,the colony growth, antimicrobial activities and composition of secondary metabolites of the strain Ty01b-8 of Penicillium sp.varied.Treatment with KCl also showed a similar effect.An alkaloid isolated from the fermentation broth of Ty01b-8 was identified as chrysogine,inhibition activity of which against Hela cells was 15.05% at 20 μ g/ml,and yield was 4.4 and 4.9 times higher in 3 percent and 6 percent NaCl treatments,respectively, compared with the non-salt culture condition. These findings prove that salinity is an important factor influencing growth and secondary metabolites of some marine fungi,which can be used to screen for new metabolites from marine fungi,and to enhance their metabolites production in industrial fermentation.