鳜鱼(Siniperca chuatsi)脂肪酸去饱和酶和延长酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,ELO)基因的全长cDNA序列。FAD基因的全长cDNA序列1882bp,编码445个氨基酸,该蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其它鱼类FAD氨基酸序列的同源性为66.5%-90.1%,系统树分析显示其与欧洲鲈鱼和金头鲷等海水鱼类的亲缘关系最近。获得的ELO基因全长cDNA序列1401bp,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其它几种鱼类ELO氨基酸序列的同源性为71.8%-86.7%,系统进化分析显示其与南方蓝鳍金枪鱼和金头鲷的亲缘关系较近。鳜鱼FAD和ELO基因全长cDNA序列的获得可为进一步研究其HUFA合成能力及调控机理奠定基础。     

黄鳍鲷（Sparus latus）两种生长激素受体的cDNA克隆及组织表达分析

采用RT-PCR方法克隆了黄鳍鲷两种生长激素受体（Growth hormone receptor,GHR）的cDNA序列,序列分析表明：GHR1开放阅读框为1935bp,共编码645个氨基酸,GHR2开放阅读框为1749bp,共编码583个氨基酸,GHR1与GHR2的氨基酸同源性为36.7%。GHR1和GHR2在分子结...     

南移养殖仿刺参（StichopusjaponicusSelenka）铁蛋白基因的克隆及表达特征分析

采用cDNA文库、RACE、荧光定量PCR和Westernblot技术,克隆了南移养殖仿刺参铁蛋白基因的全长序列,并对其表达特征进行了研究。结果表明,南移养殖仿刺参铁蛋白cDNA全长1222bp,包括187bp的5’UTR;513bp的3’UTR和编码173个氨基酸残基的522bp的开放阅读框。诸如铁结合序列标签和铁调...     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)-肌动蛋白基因的 cDNA 全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术首次克隆了曼氏无针乌贼?-肌动蛋白基因的 cDNA 全序列, 该序列全长为 2000bp, 由长 197bp 的 5’非翻译区(untranslated region, UTR), 669bp 的 3’非翻译区, 和 1134bp 的开放阅读框(open reading frame, ORF)组成。阅读框共编码 377 个氨基酸, 推算的分子量约为 42.0kDa, 理论等电点为 5.16。曼氏无针乌贼-actin 氨基酸序列中 Ile12、Ser172、Ser174、Gln223、His227、Ile231、Gly232、Ser320、Glu328、 Thr360等10个氨基酸残基具有特异性, 以及2个特殊的氨基酸残基位点和2个软体动物特有的氨基酸残基。曼氏无针乌贼?-actin 氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达 97%。NJ法系统进化分析显示曼氏无针乌贼首先与软体动物聚在一起, 然后与节肢动物聚在一起, 再与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

MOLECULAR CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR ⅠcDNA FROM LARIMICHTHYS CROCEA

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽（B、C、A、D）和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点（pI）为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis) 热休克蛋白70基因克隆与表达特征研究

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了浙江枝吻纽虫热休克蛋白70(DzHSP70)基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR方法,分析了该基因在重金属胁迫下的表达特征。结果表明,DzHSP70cDNA全长2827bp,包括294bp的5’UTR、628bp的3’UTR和编码634个氨基酸残基的1905bp的开放阅读框。HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等特征元件在DzHSP70中高度保守。重金属离子Fe3+、Pb2+和Cd2+均可上调该基因的表达,其中Pb2+的毒理效应最强。研究结果表明DzHSP70可能参与了机体对于重金属的解毒过程。     

重金属胁迫对泥蚶(Tegillarca granosa)能量代谢酶转录水平的研究

利用PCR扩增技术,从泥蚶的cDNA文库中克隆出了ATP合酶F1-β亚基基因。FOF1-ATP合酶是生物体能量代谢的重要合成酶,ATP合酶F1-β亚基是其重要组成部分。序列分析结果表明,泥蚶的ATP合酶F1-β亚基全长1944bp,包括5′端非翻译区(5′-UTR)序列246bp,3′端非翻译区(3′-UTR)序列126bp和1572bp的开放阅读框序列(ORF),编码523个氨基酸,预测分子量大小和等电点分别为54.13kDa和4.73。在重金属镉、铜、铅胁迫下,检测ATP合酶F1-β亚基和精氨酸激酶基因在转录水平的调控变化。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)两种Ⅰ型高血糖激素基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆了两种Ⅰ型高血糖激素CHH基因(分别命名为C1与C2)cDNA全序列。序列分析结果表明:C1基因全长1859bp,开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,分子量为15.326kDa,等电点为5.540;C2基因全长1739bp,开放阅读框长426bp,编码141个氨基酸,分子量为15.621kDa,等电点为7.618。与其它物种CHH氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹CHH基因与榄绿青蟹CHH基因同源性最高(92%),依次为日本鲟(80%)、三疣梭子蟹(78%)。聚类分析表明,拟穴青蟹CHH氨基酸序列与榄绿青蟹和日本鲟紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹CHH基因在眼柄、肝胰腺、心脏、肠中表达量较高,鳃、胃中表达量很少,肌肉中表达极少。盐度骤变试验结果表明:盐度胁迫24h后,C2的表达量是C1的30倍以上;C2基因盐度5时与对照组的表达量差异不显著(P>0.05),盐度15时差异显著(P<0.05),盐度22、25、30时差异极显著(P<0.01);盐度变化越大,C2的表达量越大。上述结果为进一步深入研究CHH基因的功能及调控机理奠定基础。     

企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列.cDNA全长2 308 bp,3'非编码区域(UTR)为234 bp,5'UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EEVD.结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列.与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失.两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个.系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起.该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义.     

坛紫菜碳酸酐酶基因的克隆、表达及酶活性分析

以坛紫菜丝状体为材料,采用RACE方法获得坛紫菜碳酸酐酶(CA)基因的全长cDNA。该cDNA全长1 081 bp,具有一个825 bp的开放阅读框,可编码274个氨基酸。序列同源性分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与其他物种的碳酸酐酶具有较高的一致性,其中与条斑紫菜的一致性达到96%。氨基酸序列分析表明该蛋白为β-CA,含有两个CA活性位点,无跨膜结构,可能存在一个信号肽将其定位到叶绿体中,与藻类和细菌聚类。原核诱导表达得到一个72 kDa左右的融合蛋白,酶活测定结果显示此蛋白具有碳酸酐酶活性。该实验对进一步深入研究坛紫菜CA的功能及坛紫菜碳代谢、光合作用等生理过程具有重要的参考价值。     

红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因克隆及表达分析

本文利用RACE技术克隆获得红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因全长,并利用生物信息学方法对该基因的m RNA序列特征、氨基酸序列特征、分类及系统发生进行了分析。结果表明,在红鳍笛鲷中,酪氨酸酶相关蛋白1基因含有TYRP1a和TYRP1b两个拷贝,其中TYRP1a序列全长3178bp,开放阅读框(ORF)长1566bp,5?端235bp,3?端1377bp;TYRP1b基因c DNA全长1871bp,ORF区长1656bp,5?端89bp,3?端126bp。序列分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因与其它物种的同源基因保守性较高,尤其是酪氨酸酶基因家族典型的酶活性位点序列在脊椎动物中具有高度保守性。进化分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因的种间同源性高于两个基因间的同源性。荧光定量PCR数据分析表明,TYRP1a和TYRP1b基因都在眼睛部位具有最高表达,TYRP1b在黑色皮肤也有较高表达。结果可为进一步阐述TYRP1基因在红鳍笛鲷身体和眼睛部位的色素合成机制提供一定的理论基础。     

大菱鲆生长激素基因cDNA的克隆、序列分析及分子系统研究

为了从分子水平研究大菱鲆生长激素作用机制及进化机制.以大菱鲆(Scophthalmus maximus)为材料从脑垂体中提取mRNA,利用SMART-RACE技术建立大菱鲆脑垂体cDNA文库,并从该文库中克隆出大菱鲆生长激素(growth Hormone,GH)cDNA全长序列.测序结果表明,克隆的大菱鲆GH cDNA序列全长为876 bp,包括108 bp的5'UTR和174 bp的3'UTR序列.该基因的开放阅读框全长591 bp,编码由197氨基酸残基组成的生长激素成熟肽序列,用生物软件DNASTAR计算大菱鲆生长激素蛋白分子量为1*!909.22,等电点为6.24.将大菱鲆与漠斑牙鲆、褐牙鲆等共7种鲆鲽鱼类GH成熟肽氨基酸序列进行比较分析,结果显示大菱鲆与其他6种鲆鲽鱼类序列同源性均为70%左右,而鲆科鱼类与鲽科鱼类间生长激素基因同源性很高(≥80%),说明大菱鲆与鲆科、鲽科鱼类的同源性较低.另外,运用PAUP软件对7种鲆蝶科鱼类与另外8种不同种属鱼类进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致,大菱鲆单独形成1个分支且与鲆科和鲽科鱼类相距较远,此结果为在形态学分类基础上进一步定义菱鲆属鱼类分类提供了理论依据.     

黄鳍金枪鱼巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的克隆与序列分析

采用同源克隆的方法、利用RACE技术从黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)肝脏中克隆了其MIF(TaMIF)的cDNA序列.TaMIF的cDNA全长706 bp含一个345 bp的开放阅读框,编码一个长115氨基酸的蛋白质.信号肽预测分析表明TaMIF没有信号肽.序列分析与进化分析表明,黄鳍金枪鱼与近海养殖鱼类MIF的氨基酸序列高度相似、进化地位相近,预示着深海鱼类TaMIF与近海养殖鱼类具有相似的生物学功能.研究结果是对深海鱼类MIF基因信息资料的重要补充.     

鲫鱼(Carassius auratus)slc7A8基因分子特征及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆鲫鱼slc7A8基因的全长cDNA序列,对基因序列用生物软件对基因进行生物信息分析,用Real-time PCR方法检测基因在组织中的mRNA表达丰度。结果表明,鲫鱼slc7A8cDNA全长为2709bp,包含195bp的5′UCR序列,921bp的3′UCR序列,1593bp开放阅读框,编码530个氨基酸序列;鲫鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为88.9%和95.5%,而与其他动物分别在70.1%-74.8%和80.6%-82.1%之间;预测编码蛋白的分子量为57719.84,等电点为4.8,对其结构预测显示该蛋白具有与哺乳动物十分相似的12个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守,不同动物间的同源性都在92.2%以上;Real-time PCR检测鲫鱼组织中的mRNA表达丰度高低顺序为前肠、中肠、脑、后肠、肌肉、肾、鳃、心、肝脏。     

缢蛏（Sinonovacula constricta）GST和HSP90基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达特征分析

克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长,分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明,Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp,含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码212个氨基酸,Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%;而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp,ORF为2 181 bp,编码726个氨基酸,其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现,Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达,两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后,Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05),表明氨氮胁迫引起机体的应激反应,2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限,不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。     

青虾(Macrobrachium nipponense)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因全长cDNA的克隆及表达

采用RACE技术,首次从青虾精巢中克隆得到KSPI基因全长cDNA。青虾KSPI基因cDNA全长890bp,包括80bp的5′UTR,546bp的3′UTR和编码87个氨基酸残基的264bp开放阅读框。预测蛋白包含1个保守的Kazal型结构域(CⅠX5CⅡX(6)VCⅢX(5)TYXNXCⅣX6CⅤX12CⅥ),结构域中P1活性位点为苏氨酸残基。应用MEGA4.1软件对青虾与已报道的虾类共15种KSPI氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明,青虾KSPI与同样来源于精巢的罗氏沼虾KSPI进化关系最近聚为一支,其它虾类来源于肝胰腺和血细胞的KSPI聚为另外两支。采用定量PCR技术分析其组织分布,结果显示,KSPI基因在精巢、心脏和卵巢中有较高表达,其中精巢表达水平极高,并与心脏和卵巢表达差异分别达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平,其它组织表达较弱。     

短蛸(Octopus ocellatus)过氧化物还原酶(OoPrx-4)基因的克隆及其对鳗弧菌胁迫的转录调控分析

从本研究前期构建的短蛸(Octopus ocellatus)cDNA文库中克隆得到过氧化物还原酶(OoPrx-4)基因的cDNA全长,该基因cDNA全长934bp,包括5′非编码区(UTR)19bp,3′UTR177bp,开放阅读框(ORF)738bp,共编码245个氨基酸,理论等电点为6.65,预测分子量27.1kDa。采用实时荧光定量PCR法分析了OoPrx-4基因在短蛸各组织及鳗弧菌胁迫下的表达规律,结果表明,OoPrx-4在短蛸血细胞、肌肉、系统心脏、鳃、胃、肾囊、性腺、外套膜和肝胰腺等检测组织中都有表达,其中在肝胰腺的表达量最高。经鳗弧菌刺激后,Prx-4在血细胞中的表达量分别在6h和48h出现了两次明显上调。Prx-4作为抗氧化酶可能在减少机体因抵御鳗弧菌胁迫所产生的过氧化物方面发挥重要的作用。