斑鳢(Channa maculata)微囊藻毒素去毒相关基因sGST的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术和RACE技术成功克隆淡水鱼类斑鳢sGST基因cDNA全序列,推测得到氨基酸序列,初步分析其结构功能域及系统进化关系。结果表明,斑鳢sGST基因cDNA序列全长为898bp,编码225个氨基酸。斑鳢sGST与真鲷、金头鲷、鲽、黑头鲦、川鲽、大口黑鲈等最新定名为ρ型的sGST氨基酸同源性较高,ρ型sGST为水生生物所特有并共同占据进化树上独立的分枝;与大鼠、小鼠、人等哺乳动物sGST现有所有类型同源性均很低,并且在进化树上距离也较远,表明本研究成功克隆的sGST基因应属于ρ型,可能在鱼类等水生生物对水栖环境的适应上有重要作用。     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

军曹鱼（Rachycentron canadum）生长激素基因cDNA的克隆和原核表达

运用同源克隆方法,从军曹鱼脑垂体中分离了生长激素基因（GH）的全长cDNA。结果表明,该基因cDNA全长862bp,含615bp的开放阅读框（ORF）,编码204个氨基酸;其中包括22个氨基酸的信号肽和182个氨基酸的成熟肽。采用T-A克隆构建pMD18-T-CoGH重组质粒,测序正确后经Nde I和Xho I双酶切获...     

黄鳍金枪鱼巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的克隆与序列分析

采用同源克隆的方法、利用RACE技术从黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)肝脏中克隆了其MIF(TaMIF)的cDNA序列.TaMIF的cDNA全长706 bp含一个345 bp的开放阅读框,编码一个长115氨基酸的蛋白质.信号肽预测分析表明TaMIF没有信号肽.序列分析与进化分析表明,黄鳍金枪鱼与近海养殖鱼类MIF的氨基酸序列高度相似、进化地位相近,预示着深海鱼类TaMIF与近海养殖鱼类具有相似的生物学功能.研究结果是对深海鱼类MIF基因信息资料的重要补充.     

牙鲆、石鲽和川鲽的线粒体16S rRNA基因片段的序列比较研究

以相应引物对牙鲆(Paralichthysolivaceus)和石鲽(K.areiusbicoloratus)的线粒体16SrRNA基因片段进行了PCR扩增,PCR产物经T载体连接之后进行了克隆、测序,均得到了590bp的碱基序列,并将其与GenBank中牙鲆线粒体全序列相应片段和川鲽(Platichthysflesus)相应片段进行比较,结果表明,川鲽和石鲽序列差异很小(核苷酸差异数为7,同源性为98.8%);而牙鲆与川鲽和石鲽的序列差异明显(核苷酸差异数为90～93,同源性约为84%),且大多数核苷酸变异位点集中在序列中部大约200bp的区域.     

鳜鱼(Siniperca chuatsi)脂肪酸去饱和酶和延长酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,ELO)基因的全长cDNA序列。FAD基因的全长cDNA序列1882bp,编码445个氨基酸,该蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其它鱼类FAD氨基酸序列的同源性为66.5%-90.1%,系统树分析显示其与欧洲鲈鱼和金头鲷等海水鱼类的亲缘关系最近。获得的ELO基因全长cDNA序列1401bp,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其它几种鱼类ELO氨基酸序列的同源性为71.8%-86.7%,系统进化分析显示其与南方蓝鳍金枪鱼和金头鲷的亲缘关系较近。鳜鱼FAD和ELO基因全长cDNA序列的获得可为进一步研究其HUFA合成能力及调控机理奠定基础。     

企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列.cDNA全长2 308 bp,3'非编码区域(UTR)为234 bp,5'UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EEVD.结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列.与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失.两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个.系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起.该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义.     

MOLECULAR CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR ⅠcDNA FROM LARIMICHTHYS CROCEA

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽（B、C、A、D）和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点（pI）为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。     

斜带石斑鱼胰蛋白酶原和淀粉酶全长cDNA的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼Epinephelus coioides肝胰脏克隆得到胰蛋白酶原(trypsinogen,TRY)与淀粉酶(amylase,AMY)基因cDNA全序列.斜带石斑鱼肝胰脏TRY基因cDNA全长911 bp,其中5非翻译区(5'-UTR)为55bp,3'-UTR为127bp,开放阅读框(ORF)为729bp,编码242个氨基酸,包含所有丝氨酸蛋白酶中共有的高度保守的催化活性中心.序列一致性分析发现,斜带石斑鱼与牙鲆Paralichthys olivaceus、金头鲷Sparus aurata、鳎Solea senegalensis、石鲽Pleuronectes bicoloratus的TRY序列相似性高达86.8%-89.70%,与人Homo sapiens小鼠Mus musculus、斑马鱼Danio rerio的TRY相似性较低为59.9%-64.5%.斜带石斑鱼AMY基因cDNA全长1657bp,其中5'-UTR为41bp,3'-UTR为77 bp,ORF为1539bp,编码512个氨基酸,包含与哺乳动物α-AMY二级结构相似的8个α旋和8个β折叠.序列一致性分析发现,斜带石斑鱼与澳洲肺鱼Neoceratodus forsteri、美洲拟鲽Limanda americanus、大西洋鲑Salmo salar、斑马鱼AMY基因序列相似性高达82.4%-91.8%,与人、小鼠、鸡G.Gallus的AMY基因相似性较低为70.1%-72.3%.斜带石斑鱼TRY和AMY基因cDNA全序列的成功克隆为进一步研究其表达调控机理及研发有效提高其表达水平的饲料添加剂奠定基础.     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。     

太平洋牡蛎内切葡聚糖酶基因的克隆、序列特性和表达分析

内切葡聚糖酶是一种重要的纤维素酶,在纤维素水解过程中起到重要作用。本实验利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)内切葡聚糖酶基因,并对其基因结构和系统进化进行了分析。内切葡聚糖酶cDNA全长802bp,开放阅读框架630bp,编码209个氨基酸。基因组DNA全长505 6bp,含有两段内含子长度分别为205 3和231 3bp。cDNA具有与已发现的内切葡聚糖酶基因相同的保守区结构和功能域,并且与其他已知贝类的内切葡聚糖酶有较高的同源性。利用RT-PCR方法研究了该基因在太平洋牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达,发现内切葡聚糖酶基因仅在消化腺中表达,而在其他组织中没有表达。     

Nucleotide sequence of β-tubulin gene from the soft coralscleronephthya gracillimum (kükenthal)

We cloned the complete cDNA of the β-tubulin from the soft coral,Scleronephthya gracillimum (Kükenthal) (Alcyonacea, Octocorallia, Anthozoa, Cnidaria), via the random sequencing of a cDNA library and the 5′-rapid amplification of cDNA end (RACE) technique. The full-length cDNA of theS. gracillimum β-tubulin comprised 1541 bp, not including the poly (A)⁺ stretch, also contained a complete open reading frame, which codes for a total of 445 amino acids. The amino acid residues 16-402 appeared to be in a state of conservation in a variety of animals. Northern blot analysis clearly demonstrated that the sequence we have obtained is, indeed, the full-length cDNA of the β-tubulin gene inS. gracillimum.     

脊尾白虾蜕皮抑制激素基因全长cDNA的克隆及其对环境胁迫的响应

为研究脊尾白虾蜕皮抑制激素基因(MIH)在环境适应中的作用,本文采用RACE技术从蜕皮间期脊尾白虾眼柄中克隆获得MIH-like基因全长c DNA序列,命名为Ec MIH。该基因全长1218bp,包括360bp的开放阅读框,420bp的5'端非编码区和394bp的3'端非编码区;开放阅读框编码120个氨基酸,包括41个氨基酸组成的信号肽和79个氨基酸组成的成熟肽,预测蛋白分子量为13.71k Da,理论等电点p I为8.02。同源性比较分析发现,脊尾白虾MIH-like基因与日本沼虾和罗氏沼虾同源性最高,分别为87%和86%。荧光定量PCR分析结果表明,脊尾白虾MIH-like基因在眼柄中的表达量最高,在卵巢中的表达量最少,而在肝脏、肌肉、鳃和血细胞中不表达。环境胁迫后该基因具有明显的时序性。p H6.5胁迫后24h和48h,眼柄和腹神经节中MIH-like基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05);4mg/L氨氮浓度组胁迫后12h和24h,眼柄和腹神经节中MIH-like基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05);盐度39胁迫后12h和24h,眼柄和腹神经节中MIH-like基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05)。本研究结果表明脊尾白虾mih基因参与了环境胁迫后的机体应激反应。     

缢蛏多巴胺受体基因及其在损伤修复中的作用

多巴胺受体(dopamine receptor)作为生物体中重要的神经递质受体, 在生物体的生长、发育、代谢等多个生理过程中都发挥着重要的功能。本研究从缢蛏Sinonovacula constricta转录组文库中筛选获得多巴胺受体基因的部分片段, 结合RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术和降落 PCR(polymerase chain reaction)技术, 克隆得到缢蛏两个多巴胺受体的选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)的变异体, 命名为ScDopR2a和 ScDopR2b, 长度分别为1824bp和2758bp。两个变异体均包含相同的5′非翻译区(untranslated regions, UTR)(24bp)和开放阅读框(open reading frame, ORF)(1440bp), 共编码479个氨基酸残基。但是两个变异体的3′UTR 长度不同, 分别为360bp和1294bp, 其中ScDopR2b在polyA尾前插入936bp。在同源的ORF区设计引物, 采用实时定量PCR分析多巴胺受体基因在不同组织中的表达特征, 结果表明多巴胺受体基因在水管、鳃、斧足的表达量显著高于其他组织。在该基因序列3′UTR插入片段区域设计特异引物检测ScDopR2b的组织表达情况, 结果表明在水管、鳃、斧足的表达量仍高于其他组织, 表达趋势与ORF区大致相同。进一步设计缢蛏组织损伤实验, 对进水管前端进行损伤处理, 在处理后的第4h、8h、12h、24h、48h、60h和72h取样, 荧光定量检测结果显示, 同源区表达量在12h和48h呈上调, 在8h、24h和72h下调, 且ScDopR2b表达趋势与同源区表达模式大致相同。研究结果表明, 缢蛏多巴胺受体参与了损伤修复过程, 其表达特征可能与多巴胺作为补偿性神经递质的作用有关。     

太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica) CRH-BP基因克隆及表达分析

促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(CRH-BP)是一种糖基化蛋白,与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)具有很高的亲和力,对CRH诱导的脑垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放起到抑制作用。本研究采用RT-PCR与RACE基因克隆方法首次获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)CRH-BP基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MF289345)1950bp,其中ORF区1245bp编码415个氨基酸,5′非编码区841bp,3′非编码区294bp,理论分子量/等电点为45.816/5.87。生物学序列分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP氨基酸序列与桡足类中近亲真宽水蚤同源性最高;具有6个蛋白修饰位点及蛋白家族标签序列,具有明显的跨膜结构域及信号肽。实时荧光定量PCR分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP基因在盐度、温度及pH环境胁迫中的mRNA表达量均具有一定的时间梯度表达性与浓度梯度表达性特征。本文通过对太平洋真宽水蚤CRH-BP基因结构及不同环境因子刺激下的表达特点的研究为探究桡足类在环境应激、生殖生理及免疫调控等方面奠定了理论基础。     

Molecular cloning and expression analysis of Crustin-like gene from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

A new member of antimicrobial protein genes of the Crustin family was cloned from haemocytes of the Chinese shrimp Fennero- penaeus chinensis by 3 ′and 5′ RACE. The full-length cDNA of Crustin-like gene contains a 390 bp open reading frame, encoding 130 amino acids. The deduced peptide contains a putative signal peptide of 17 amino acids and mature peptide of 113 amino acids. The molecular mass of the deduced mature peptide is 12. 3 ku. It is highly cationic with a theoretical isoelectric point of 8.5. The deduced amino acids sequence of this Crustin showed high homology with those of Penaeus （ Litopenaeus ） setferus. Northern blotting showed that the cloned Crustin gene was mainly expressed in haemocytes, gill, intestine, and RNA in situ hybridization indicated that the Crustin gene was constitutively expressed exclusively in haemocytes of these tissues. Capillary elec- trophoresis RT-PCR analysis showed that Crustin was up-regulated dramatically from 12 to 48 h after a brief decrease of mRNA during first 6 h in response to microbe infection. The level of Crustin mRNA began to restore at 72 h post-challenge. This indicated that Crustin gene might play an important role when shrimps are infected by bacterial pathogen.     

Cloning a new cytochrome P450 isoform (CYP356A1) from oyster Crassostrea gigas

We have cloned the full-length cDNA of the first member of a new cytochrome P450 (CYP) family from the Pacific oyster Crassostrea gigas. This new CYP gene was obtained based on an initial 331bp fragment previously identified among the list of the differentially expressed genes in oysters exposed to untreated domestic sewage. The full-length CYP has an open reading frame of 1500bp and based on its deduced amino acid sequence was classified as a member of a new subfamily, CYP356A1. A phylogenetic analysis showed that CYP356A1 is closely related to members of the CYP17 and CYP1 subfamilies. Semi-quantitative RT-PCR was performed to analyze the CYP356A1 expression in different tissues of the oyster (digestive gland, gill, mantle and adductor muscle). Results showed slightly higher CYP356A1 expression in digestive gland and mantle, than the other tissues, indicating a possible role of the CYP356A1 in xenobiotic biotransformation and/or steroid metabolism.     

cDNA cloning and mRNA expression of the translationally controlled tumor protein (TCTP) gene from Japanese sea perch (Lateolabrax japonicus)

1 Introduction T he translationally controlled tum or protein(TC TP) w as firstdescribed as a grow th-related proteinin m ouse E hrilisch ascites tum or cells and ery-throleukem ia cells (Y enofsky etal., 1983). Subse-quently, TC TP w as founded to be present in m anycells (Sanchez etal., 1997; G ross etal., 1989; C hunget al., 2000; V ercoutter-Edouart et al., 2001) exceptthe hum an kidney cell(Sanchez etal.,1997;G achetetal., 1999). H om ologues of TC TP have been reportedfrom sever…     

缢蛏（Sinonovacula constricta）GST和HSP90基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达特征分析

克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长，分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明，Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp，含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码212个氨基酸，Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%；而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp，ORF为2 181 bp，编码726个氨基酸，其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现，Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达，两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05)，表明氨氮胁迫引起机体的应激反应，2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限，不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。