南麂岛海洋沉积物中抗大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病弧菌的放线菌分离和筛选研究

采用平板涂布法从南麂岛近海海洋沉积物样品中分得86株放线菌,用琼脂块法和杯碟法结合筛选出对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)两种大黄鱼病原性弧菌具有不同拮抗作用的海洋放线菌5株,其中编号NJR0956的菌株对两种致病菌的抑菌圈直径均25mm,表现出较强的抑制作用;进而测定了5株活性菌株的抗菌谱。结果表明,它们对指示菌中的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)四种病原弧菌均具有较好的拮抗作用;在对NJR0956的抑菌效果研究中发现,该菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中不仅能够增殖,而且能够有效地抑制病原菌的生长。     

大黄鱼病原弧菌拮抗放线菌的筛选与人工诱变

从厦门集美海滩底泥分离得到38株放线菌，用琼脂块法测定它们对大黄鱼病原弧菌-溶藻弧菌和副溶血弧菌的拮抗效果，选择两株拮抗效果较好的放线菌进行诱变，测定诱变后各菌株的抗菌效果，并选择抗菌效果较好的菌株进行第二次诱变，如此反复诱变3次，共得到97株放线菌，结果表明；38株放线菌中的22株对两株病原菌有一定的拮抗作用；用紫外线照射可以获得少量对两株病原菌拮抗作用加强的菌株。     

大黄鱼病原弧菌拮抗菌筛选

用平板涂布法从集美海边分离到381株细菌,用平板划线法或点种法检验这些海洋细菌对两株病原弧菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的拮抗作用。从中挑选2株对海水养殖动物病原弧菌有较好拮抗作用的细菌,编号为GX75和GZ46。对拮抗菌(GX75和GZ46进行了抗菌谱测定,结果表明,GX75对9株指示菌中的副溶血弧菌、河流弧菌和坎普氏弧菌有较好的拮抗作用,GZ46对副溶血弧菌、溶藻弧菌和坎普氏弧菌有较好的桔抗作用。在营养肉汤中,测定了GX75和GZ46的抗菌作用,表明(GX75和GZ46对副溶血弧菌拮抗作用很明显。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

大黄鱼病原副溶血弧菌拮抗菌的筛选

用点种法从大黄鱼肠道优势菌群中筛选出104株病原性副溶血弧菌的拮抗菌,进一步研究拮抗效果最好的11株拮抗菌的抗菌谱和生长曲线,其中NAC平板上筛选的4株拮抗菌的抗菌范围较广,锰营养琼脂培养基上筛选的3株拮抗菌具有生长优势。用BIOLOG板测定了抗菌谱较广、有一定生长优势3株拮抗菌(R22,Y58和J312)的碳源利用情况,结果表明,3株拮抗菌的碳源谱都比较广,都能利用糖类、有机酸和氨基酸等,而且与鱼类营养的竞争较小。16S rRNA基因同源性分析的结果显示与R22,Y58,J312同源性达99%以上的菌株分别来自弧菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。进一步对R22,J312和Y58三株拮抗菌进行生化鉴定,结果显示R22为溶藻弧菌,J312为荧光假单胞菌,但Y58的种属未能得到确认。所得到的3株拮抗菌R22,Y58,J312在拮抗病原菌、抗菌谱、生长特性和营养利用等方面都初步满足益生菌的筛选条件,有待进一步检测其安全性和实用效果以便能够成为能实用的益生菌。     

来自大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定

采用点种法并以副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)为弧菌指示菌,对从健康的大黄鱼肠道内分离的115株细菌进行体外拮抗试验。并对筛选出的拮抗菌进行抗菌谱测定,最后利用VITEK-32细菌快速鉴定系统和16SrRNA基因序列对拮抗菌进行鉴定。结果表明,从中筛选到3株有较强拮抗作用的菌株,编号分别为X1402-1、X1108和X3914,且菌株X1402-1的抗菌作用最强,抗菌谱最广,21株病原指示菌中,对16株均能产生较强的抑制作用,其中对Vp-1.2164的抑菌直径最大,达到28.5mm,对Va-Y的抑菌直径为8.7mm;其次为菌株X1108和X3914,对两种指示弧菌的抑菌直径分别为:12.0mm、9.0mm和0mm、7.2mm。经VITEK-32细菌快速鉴定系统鉴定,3株拮抗菌分别与铜绿假单胞菌,恶臭假单胞菌,地衣芽孢杆菌的相似性均为99%。通过16SrRNA基因序列分析表明,3株拮抗菌分别与类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU419918)、恶臭假单胞菌Pseudomon asputida(FJ440105)和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(DQ988136)的16SrRNA基因同源性最高,分别为100.0%、97.5%、99.0%。综合分析试验结果,X1402-1、X1108和X3914分别被确定为类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌和地衣芽孢杆菌。     

弧菌拮抗菌的筛选

用平板划线或点种法对 6 0 2株海洋细菌进行筛选 ,得到 4株对海水养殖动物 (鱼、虾、贝 )的病原菌有拮抗作用的细菌。并对拮抗菌 QJ2的拮抗作用进行了研究 ,结果为 :QJ2有广泛的弧菌抗菌谱 ,对 37株弧菌的抗菌阳性率达到 89.2 % (33/ 37) ;用活菌平板计数法和 O.D.60 0 nm研究了QJ2培养物的去细胞上清液 (CFS)与病原菌 W- 1的作用动力学 ,15min时 W- 1的细菌数便开始减少 ,4 h时细菌数最少 ,6 h后开始增加 ,而对照组的细菌数呈逐渐上升趋势 ;QJ2对自身的拮抗物质不敏感 ;QJ2抗性物质的分子量不大于 80 0 0 Da;经常规生理生化方法和 API- 2 0细菌快速鉴定系统鉴定 ,QJ2为气味黄杆菌 (Flavobacterium odoratum)。     

4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定

采用体外拮抗试验的方法，先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的96株细菌中筛选出4株对病原菌（鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌）有拮抗作用的细菌；进一步通过固体扩散法和液体混合法确定LV060806、LV060808的产物对鳗弧菌有明显抑制作用，Lv060806、LV060815的产物对副溶血弧菌有明显抑制作用，LV060810、LV060815的产物对哈维氏弧菌有明显抑制作用。溶血试验证实这些菌株不产生溶血素，不具有潜在的致病性；动物安全性实验证实菌株浓度在10^6 cfu／ml以下对实验对虾无明显的毒害作用。随后测定了其16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发生树，结合菌株表型特征和生理生化特性最终鉴定结果为：LV060806、LV060808为Vibrio natriegens；LV060810、LV060815为V.alginolyticus。     

一株生防细菌LHB02的筛选、鉴定及其发酵条件优化(英文)

从中国福建沿海某一污染滩涂的沉积物中筛选到一株具有较强拮抗水产病原菌的生防细菌LHB02。采用通用引物,对LHB02的16SrRNA片段进行扩增,获得1511bp的DNA系列,基于该DNA系列,结合细菌形态学、生理生化特征,鉴定LHB02为一株枯草芽孢杆菌。对LHB02进行了抗菌试验、抗菌谱检测和发酵条件优化研究,结果表明,LHB02对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等有很强的拮抗作用,其优化后的发酵条件为:KB培养基(蛋白胨20g,丙三醇10mL,K2HPO41.5g,MgSO4.7H2O1.5g,H2O1000mL);温度28°C,pH值7.0,培养时间36h,接种量1.5%。     

深圳福田红树林生态中放线菌的筛选及其抗菌活性测定

从深圳福田红树林根际于不同季节采集的3份土样和2份水样中分离得到95株放线菌,94%的放线菌为链霉菌科。测定95株放线菌发酵液对病菌的抗菌活性,82%的放线菌发酵液有不同程度的抗菌作用,对革兰氏阳性细菌(G )的抗菌作用最强。测定其中6株放线菌发酵液对细菌、霉菌和酵母的抗菌活性,各具有不同的抗菌谱:s33,s48和s68具有广谱的抗菌活性;s10和s87只能抑制细菌;s67b不能抑制革兰氏阴性细菌(G-)。s10发酵液的最小抑菌浓度<0.125μL/mL。     

噬菌体防治皱纹盘鲍脓疱病的研究

于１９９３年６月在大连太平洋海珍品养殖公司的１２个采集点分离到河流弧菌的Ⅱ的噬菌体,依据过量噬菌体可以全部裂解其宿主菌河流弧菌Ⅱ的特性,用噬菌体对皱纹盘鲍脓疱病进行了生物防治研究。结果表明,使用一定浓度的噬菌体可以有效地治疗或推迟脓疱病引起的鲍死亡,可将鲍的成活率提高５０％以上。探讨了在噬菌生物防治中遇到的难题及解决办法、噬菌体分离规律等问题。     

The occurrence of pathogenic bacteria in some ships' ballast water incoming from various marine regions to the Sea of Marmara,Turkey

The composition and frequency of antibiotic resistance of pathogenic bacteria, the abundance of heterotrophic aerobic bacteria (HPC) and possible in-situ use of chromogenic agar were investigated in the ships' ballast water coming from different regions of the world to the Sea of Marmara, Turkey for the first time. The samples that were taken from 21 unit ships coming from various marine environments of the Southern China Sea, the Atlantic Ocean, the Mediterranean and the Black Sea to the Sea of Marmara, Turkey in 2009 and 2010 were tested. 38 bacteria species, 27 of them pathogenic bacteria belonging to 17 familia, were detected. Vibrio cholera was not detected in the samples. However, the presence of a high number of HPC, including a cocktail of pathogenic bacteria showed that the ships carry a potential risk for the Sea of Marmara.     

养殖大菱鲆烂鳍病病原菌的鉴定及系统发育学研究

从山东半岛3个养殖场各分离到一株大菱鲆烂鳍病的病原菌,均为革兰氏阴性,短杆状,极生鞭毛,有运动能力,菌落半透明。经常规生理生化特征测试和16SrRNA基因序列对比,表明它们都是同一种细菌。理化特征的结果显示这3株菌均与V．anguillarum的表性特征非常相似。对其16SrRNA基因序列进行分析,并构建了系统发育树,结果表明这些菌株与V．anguillarum亲缘关系最近。综合上述研究结果,将该菌鉴定为V．anguillarum.     

哈维氏弧菌VIB645毒性相关质粒的结构解析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖动物的常见致病菌。前期研究发现,哈维氏弧菌致病性最强的菌株VIB645含有2个核苷酸序列非常相似的溶血素基因—vhhA和vhhB,分别位于染色体DNA和1个大小约为65.6 kb的质粒上(命名为pVH1)。本研究用碱裂解法提取该菌株的毒性相关质粒pVH1,利用多种限制性内切酶进行酶切,构建随机DNA文库并测序。合计测序97.63 kb,覆盖度为148.3%,鉴定出125个ORF(开放阅读框,>150 bp)。这些预测的ORF,根据其功能主要分为以下几类:(1)毒力相关基因,包括RTX毒素钙离子结合蛋白、转铁蛋白结合蛋白A前体、外膜粘附蛋白;(2)结合转运相关基因,包括TraC、-D-、F-、G-、H-、I-、K-、N-、U-、W、TrbB-、C;(3)转座相关基因;(4)其他功能基因,如甲基转移酶,DNA结合蛋白,DNA复制蛋白DnaC等;(5)未知基因。本研究结果对揭示哈维氏弧菌的致病机理具有重要意义。     

牙鲆肠道内弧菌拮抗菌的分离与筛选

根据微生态学原理,用普通培养基和选择性培养基相结合的方法,分离健康牙鲆肠道内的固有菌群。对获得的菌株进行弧菌的抑制试验,以筛选弧菌拮抗菌。用点种法初步筛选出6株对致病性弧菌有不同抑制作用的拮抗细菌（G12,G13,G14,G15,G16,Y1-13）。进一步研究它们的抑菌活性,在上清液抑菌试验中,G12,G13,G14,G15,G16这5株菌均未表现出抑菌作用,表明它们的抑菌活性较弱,而且受环境条件的影响。在Y1-13和弧菌混合培养实验中,弧菌的数量均明显低于对照组弧菌的数量,表明Y1-13对弧菌具有较强的抑制作用,有望通过生物学和鱼体保护等方面的研究,将其制成微生态制剂应用于牙鲆的养殖。     

海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究

从福建宁德地区患病大黄鱼肝、肾、脾等组织分离出３株病原菌,进行纯化培养、人工感染、药敏试验及菌种鉴定等研究,根据形态及生理生化特征,其中２株致病菌归为哈维氏弧菌,另一株为腐败假单胞菌。药敏实验的结果表明,氟哌酸、环丙氟哌酸、氯霉素、庆大霉素和复方新诺明等对致病菌有较强的抑制作用。     

虾夷扇贝育苗阶段幼体细菌性病原的确定

本研究确定了獐子岛集团虾夷扇贝Patinopecten yessoensis育苗过程中幼体大规模死亡的病原菌。采用TCBS培养基从患病幼体中分离弧菌,其数量为1.12×10⁴ CFU/g,以V1菌株和V2菌株为优势菌,占总弧菌数的64.3%和32.1%。用血琼脂平板测定V1菌株和V2菌株的溶血性,2株菌分别呈β溶血和α溶血。用2株菌分别感染扇贝幼体,幼体的死亡率显著高于对照组(P<0.05),症状与自然状态下的发病症状一致,并且从感染死亡的幼体中分离到原感染菌株,确定V1菌株和V2菌株是造成扇贝幼体大规模死亡的病原菌。对2株病原菌进行致病基因分析,结果发现V1菌株含有胞外金属蛋白酶基因。经16S rRNA基因测序分析,V1菌株(GenBank登录号KR232924)和V2菌株(GenBank登录号KR232925)与Vibrio splendidus ctt 31/5 和 Vibrio tasmaniensis 007的相似度分别为99.9%和99.2%。用药敏纸片扩散法检测病原菌对常见抗生素的敏感性,结果表明利福平、氟苯尼考和磺胺异恶唑均能有效抑制病原菌的生长。     

人工养殖点带石斑鱼弧菌病病原菌的分离及鉴定

广东、海南两省多个海水网箱养殖场养殖的点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)发生严重的弧菌病,从海南三亚和广东深圳的发病鱼病灶上分离到2株致病性细菌VAL02和VAL00,经人工回接感染实验证明这2株菌引起点带石斑鱼弧菌病,VAL02对点带石斑鱼苗的半致死量是2.25×10~5 cfu/g。经形态及生理生化特征分析,鉴定出VAL02及VAL00均为溶藻弧菌。应用药敏纸片法研究了22种化学疗剂对VAL02及溶藻弧菌标准株的生长抑制作用,发现VAL02对氯霉素、氟哌酸、卡那霉素和乙酰螺旋霉素等产生耐药性,对复方新诺明和环丙沙星等敏感。