虾夷扇贝人工诱导雌核发育精子遗传失活及紫外线照射对精子形态结构影响的研究

在1698μWcm-2s^-1的紫外线照射强度下，虾夷扇贝雌核单倍体的最佳诱导时间为60s。从早期胚胎存活率可以观察到Hertwig效应的存在。随着照射时间增加，受精率明显下降，而受精卵在到达D形幼虫期之前便停止发育。扫描电镜显示，随着紫外线照射强度的增加。精子顶体和鞭毛结构趋向于受到更大程度的破坏，直到完全失去顶体和鞭毛。并指出这可能是造成受精率降低的主要原因。     

牙鲆同质雌核发育二倍体的诱导及其早期生长研究

人工诱导雌核发育是水产动物性别控制的重要技术手段之一,同时也是快速建立近交系或纯系、建立遗传作图群体的方法之一。采用静水压力抑制受精卵第一次卵裂的方法诱导了牙鲆同质雌核发育二倍体。不同的处理起始时刻、不同压力及压力持续的时间对受精卵的发育及染色体加倍率有较大影响。处理组受精卵发育相对缓慢,畸形率较高,正常仔鱼孵化率较低。如果处理前受精卵保持在(15.5±0.5)℃,压力处理受精卵的最佳条件是:从受精后75 min开始、用55 MPa的压力处理6 min,该条件下处理组正常仔鱼孵化率较高,为13.7%,染色体观察和最大核仁数计数结果表明,此时的二倍体诱导率也最高。染色体观察结果还显示在不同处理组中存在不同比例的非整倍体。利用获得的最佳诱导条件处理获得了数千尾雌核发育幼鱼,观察表明,雌核发二倍体鱼的生长速度明显低于普通二倍体,且个体间差异较大。该研究为进一步开展牙鲆全雌育种和连锁图谱的构建提供技术支撑。     

人工诱导栉孔扇贝雌核发育胚胎的SNP标记分析

利用紫外线照射灭活的同源精子,激活栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子分裂,获得雌核发育胚胎,流式细胞仪检测胚胎细胞平均单倍体率为82.5%。对获得的胚胎进行全基因组扩增,获得足量的基因分型模板,利用高分辨率溶解曲线(HRM)技术对其进行96个单核苷酸多态性(SNP)位点分型。结果显示,诱导雌核发育胚胎的位点检出率为96.27%,其中99.06%的位点分型结果与相应雌性亲本相符;单个胚胎中只表现一种等位形式的位点占91.67%~96.88%,平均为94.81%,较雌性亲本的纯合位点比例(64.25%)明显提高。本研究利用灭活同源精子诱导获得栉孔扇贝雌核发育胚胎,并利用单个胚胎的全基因组扩增产物进行基因位点分析,为扇贝人工诱导雌核发育个体的早期多基因位点检测和评价提供参考。     

电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的相关参数的筛选

电刺激可诱导卵子雌核发育,但在海洋生物中尚无报道。为获得电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的最佳条件,采用正交设计的方法,分别研究了电场强度、电容、脉冲次数、卵子密度及缓冲液种类对诱导效果的影响。结果表明:(1)不同缓冲液的诱导效果差异不显著(P>0.05),但甘露醇缓冲液的诱导效果优于Zimmerman氏缓冲液和山梨醇缓冲液;最佳卵子密度为11.25×104个/mL,场强的最适范围为1.00～1.75kV/cm。最优电刺激诱导条件组合是:0.30mol/L甘露醇缓冲液,卵子密度11.25×104个/mL,脉冲强度1.20kV/cm,电容3μF,2次电脉冲。(2)应用优化后的电刺激参数诱导雌核发育,获得了最佳的诱导效果,得到的卵裂率为28.16%,胚胎存活率为98.37%。本研究首次成功应用电刺激法诱导了栉孔扇贝的雌核发育,并得到了单倍体胚胎,初步建立了栉孔扇贝中该诱导法的参数体系。     

对照组和雌核发育牙鲆血清中睾酮与雌二醇水平的比较

采用放射性免疫方法测定和比较了人工诱导的雌核发育牙鲆（Paralichthys olivaceus）与对照组牙鲆血清中睾酮（T）和雌二醇（E2）水平。研究发现, 雌核发育牙鲆个体中的T 含量显著高于对照组牙鲆个体（P〈0.05）, 而其E2 含量则略低于对照组个体; 在雌核发育牙鲆中, 卵巢发育不正常的个体比发育正常的...     

刺参雌核发育二倍体的诱导及其早期生长发育

紫外线照射使精子遗传物质失活,用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放,诱导刺参(Apostichopusjaponicus)雌核发育二倍体。用强度为2561μW/(cm2.s)的紫外线(254 nm)照射不同时间的精子与正常卵子受精。结果发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼虫发生率逐渐降低,照射30 s时小耳幼虫发生率降为0。受精后35 min,显微镜下观察到有20%~30%受精卵排出第1极体时,用浓度0.5μg/mL的CB持续处理受精卵20 min,诱导出刺参第二极体抑制型雌核发育二倍体,雌核发育二倍体发育速度低于正常二倍体。微卫星分析表明,雌核发育二倍体诱导成功率为93.3%。     

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)雌核发育的人工诱导与鉴定

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)是我国重要的经济鱼类,具有复性染色体性别决定型(X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y)。利用紫外线(UV)灭活的同源精子通过冷休克方法诱导了条石鲷的雌核发育,筛选精子紫外灭活剂量并优化冷休克相关参数。结果表明:条石鲷精子最适的灭活剂量为80 mJ/cm2雌核发育的最适条件为授精后2 min在3～4°C水温下处理10 min。条石鲷雌核发育子代经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体,进一步利用微卫星分析表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本没有父本基因参与。对子代的性比和生长进行了比较,结果表明条石鲷雌核发育后代均为雌性,15月龄后雌核发育后代比普通条石鲷具有更快的生长速度。研究结果为条石鲷单性苗种的培育及其性别决定机制的深入研究提供基础。     

雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达

于1998年4、5月在山东省荣成市寻出水产公司养鱼场人工采集牙Ping成熟精卵，紫外线灭活精子遗传物质，冷休克诱导，获得雌核发育牙Ping。1999年5月收集57尾雌核发育牙Ping生化样品，采用淀粉胶电泳分析了LDH、IDHP、PGM、ACP、ADH、SDH、GDH、CAT等8种在野生种群中为多态的同工酶。结果表明，牙Ping雌核发育群体的Ldh-C、Cat两个基因座位发生了重组，基因座位与着丝点之间的重组率分别为52．6％和29．8％；Idhp－1有父方基因表达现象，说明雌核发育过程中父方基因可能在分子水平整合。牙Ping雌核发育群体的多态座位比例和平均杂合度分别为7．0％和0．035，远低于野生种群；研究表明，通过抑制第二极体排出获得的牙Ping雌核发子代尚有一定基因杂合，不能用于培育纯系。     

栉孔扇贝雌核发育二倍体早期成活与生长发育的研究

利用筛选出的精子遗传失活法和卵染色体加倍法,批量诱导出第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体个体,观测了幼体不同发育时期的成活率、发育速度和个体大小等生物学特性。结果发现,雌核发育二倍体的卵裂率、胚胎畸形率、D形幼虫发生率、孵化后3,6,9,12,15,18 d的成活率均显著低于对照组,表明栉孔扇贝基因组中可能存在大量有害隐性基因,雌核发育个体中有害隐性基因的纯合导致了成活率的显著下降。在发育速度方面,D形幼虫期之前,雌核发育二倍体个体明显低于对照组个体;壳顶期后则相反,雌核发育二倍体个体高于对照组个体。在个体大小方面,雌核发育二倍体个体在孵化后3 d前,壳长和壳高均小于对照组个体;孵化3 d后,壳长和壳高逐渐大于对照组个体。这一结果显示随着致死隐性基因因纯合而被自然排除,雌核发育二倍体的生长性状逐渐优越于正常个体,通过将这些雌核发育二倍体个体培养至成体,则可望培育出栉孔扇贝的优良品系。