荧光分光光度法测定海洋生物中的谷胱甘肽

对应用荧光分光光度法测定海洋生物中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的方法进行了研究，并测定了分属于鱼、虾、贝、藻的10种海洋生物中谷胱甘肽的含量。利用邻苯二甲醛与GSH反应构成的荧光体系，在激发波长为365nm，发射波长为425nm的条件下，方法的回收率为99．22％-99．69％，变异系数为2．16％。应用此方法测得10种海洋生物中谷胱甘肽的含量为：红笛鲷（Lutjanus sanguineus）0．399mg／g，银鲳（Pampus argenteus）0．352mg／g，大海鲢（Megalops cyrinoides）0．561mg/g，尖紫蛤（Sanguinolaria acuta）0．289mg/g，菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarun）0．287mg／g，墨吉对虾（Penaeus merguiensis）0．892mg／g，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）1．434mg／g，囊藻（Colpomenia sinuose）0．221mg／g，石莼（Ulva lactucal）0．727mg／g，马尾藻（Sargassum muticum）0．137mg／g。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性

硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。     

黄斑篮子鱼去毒相关基因的克隆与肝脏组成型表达分析

从基因水平探讨海洋鱼类对海洋藻毒素的去毒分子机理。采用RT-PCR法成功克隆了黄斑篮子鱼Siganus oramin肝脏I时相代谢酶细胞色素P450 1A(CYP1A)、II时相代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)和rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70 (HSP70)、alpha 1型钠钾ATP酶(ATP1A1)及β-肌动蛋白(beta-actin, ACT)基因cDNA核心序列，序列分别长879 bp、582 bp、588 bp、660 bp、749 bp和554 bp。序列同源性分析发现，属鲈形目的黄斑篮子鱼CYP1A、GSTA和GSTR与同属鲈形目的牙鲆Paralichthys olivaceus、欧洲鲽Pleuronectes platessa、真鲷Pagrus major、鲤形目的斑马鱼Brachydanio rerio 相应氨基酸序列同源性较高，CYP1A和GSTA与非洲爪蟾(两栖类)、鸡(鸟类)、小鼠、大鼠和人(哺乳类)相应氨基酸序列同源性低，这可能与鱼类I、II时相去毒酶基因承担水环境毒素去毒代谢的特殊功能有关；而HSP70、ATP1A和β-肌动蛋白在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中均有较高的同源性，这可能与这些基因在机体中承担的最基本的生命功能相关。应用半定量RT-PCR的方法，以β-肌动蛋白作为外参照，在指数期增长范围内分别得到了CYP1A、GSTA、GSTR、HSP70和ATP1A1 mRNA与β-肌动蛋白mRNA (%)的比值，确定黄斑篮子鱼肝脏去毒相关基因的组成型表达水平。其中，黄斑篮子鱼肝脏CYP1A、GSTA和GSTR基因组成型表达相对较高，HSP70和ATP1A1基因组成型表达相对较低，这可能与不同基因在黄斑篮子鱼海洋藻毒素去毒分子机理中承担的作用相关，为海洋藻毒素在海洋鱼类中的积聚及代谢去毒分子机制的研究提供了相关数据。     

三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析

为了研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)HMGR基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:KF280756)。该序列全长2575bp,包括一个53bp的5′端非编码区,一个686bp的3′端非编码区和一个长度为1836bp的开放阅读框,编码611个氨基酸。该氨基酸序列与已公布的美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列相比一致性达65%,具有Ⅰ型HMGR保守催化区域、两个HMG-Co A结合基序和两个NADP(H)结合基序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析三疣梭子蟹HMGR基因的组织差异表达及在蜕皮周期中的表达水平变化,结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹大颚器(MO)中的表达量最高,在其它组织中表达量均极低;在三疣梭子蟹蜕皮周期中,大颚器中HMGR基因的表达量自A期至D0亚期升至最高,然后下降,至D4亚期最低。验证了大颚器是三疣梭子蟹合成甲基法尼酯的唯一器官,表明HMGR在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要作用。     

荧光分光光度法测定海洋生物中的谷胱甘肽

对应用荧光分光光度法测定海洋生物中还原型谷胱甘肽(GSH)含量的方法进行了研究,并测定了分属于鱼、虾、贝、藻的10种海洋生物中谷胱甘肽的含量。利用邻苯二甲醛与GSH反应构成的荧光体系,在激发波长为365nm,发射波长为425nm的条件下,方法的回收率为99.22%~99.69%,变异系数为2.16%。应用此方法测得10种海洋生物中谷胱甘肽的含量为:红笛鲷(Lutjanussanguineus)0.399mg/g,银鲳(Pampusargenteus)0.352mg/g,大海鲢(Megalopscyrinoides)0.561mg/g,尖紫蛤(Sanguinolariaacuta)0.289mg/g,菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarun)0.287mg/g,墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)0.892mg/g,凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)1.434mg/g,囊藻(Colpomeniasinu-ose)0.221mg/g,石莼(Ulvalactucal)0.727mg/g,马尾藻(Sargassummuticum)0.137mg/g。     

逆转座子序列插入——海湾扇贝过氧化物还原酶V 第1 内含子分析

根据海湾扇贝(Argopecten irradians)过氧化物还原酶V(AiPrxV)的cDNA序列和部分基因组DNA序列设计引物,采用基因组步移方法扩增获得其第1内含子(I1)完整序列,并通过Blast比对、DNAMAN和RepFind搜索进行序列分析。AiPrxV I1长8 565bp,占AiPrxV基因全长的68%,AT%显著高于GC%。在5 900-6 700bp的区域中包含了不完整的编码区,经分析与文昌鱼、海胆的逆转录酶有极高的相似性,其N端与多种动植物逆转座子的逆转录酶C端具有相似特征。此外,发现AiPrxV I1中包含283个重复序列,在3 500-4 000bp和6 800-7 200bp区域尤为密集。以上特点提示海湾扇贝过氧化物还原酶V第1内含子可能是由一个非长末端重复元件逆转座子(non-LTR retrotransposons)插入,逐渐演变而形成的。     

氨氮胁迫对拟穴青蟹组织器官中SOD及GPX活性的影响

采用实验生态学的方法,探讨海水中分别添加氨氮（以氯化铵作为氨氮源）0（对照组,C0组）、10（C10组）、20（C20组）、30（C30组）、40 mg/dm3（C40组）,胁迫24、48、72、96 h对拟穴青蟹（Scylla paramamosain）各组织器官中SOD、GPX活性的影响.结果表明,拟穴青蟹鳃中SOD活性,除C40组外,其余各组在胁迫24、48 h随氨氮含量升高而升高,胁迫72、96 h则随氨氮含量升高而下降（p〈0.05）,C40组的则随胁迫时间延长而一直呈下降趋势;各组拟穴青蟹鳃、肝胰腺和肌肉的SOD活性变化趋势相同,鳃和肌肉SOD活性最高均出现在胁迫48 h,肝胰腺SOD活性最高则在胁迫72 h.各组拟穴青蟹鳃GPX活性在胁迫24、48和72 h随氨氮含量升高而下降,胁迫96 h随氨氮含量升高而增大;各组拟穴青蟹肝胰腺和肌肉GPX活性变化与肝胰腺SOD活性变化趋势相似,胁迫48 h,C40组拟穴青蟹肝胰腺GPX活性最高.氨氮胁迫显著影响拟穴青蟹生理效应.     

噻唑烷酸对肝组织GSH含量的影响及其作用机制的研究

建立丁胱亚磺酰亚胺(L-Buthionine Sulfoximine,BSO)排空小鼠肝组织谷胱甘肽(Glutathione,GSH)模型,研究噻唑烷酸(N-acetyl-glucosamine-thiazolidine-4(R)-carboxylic acid,GlcNAcCys)提高肝组织GSH含量,保护肝脏免受外源性毒物、药物损伤的可能机制。正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水,BSO组及GlcNAcCys不同剂量组小鼠注射BSO(6mmol/kg体质量,i.p.)。2 h后,正常对照组和BSO组注射生理盐水,GlcNAcCys低、中、高剂量组分别注射不同剂量的GlcNAcCys(200、4009、00 mg/kg体质量)。6 h后,用Ellman’s法测定肝匀浆总巯基(Total Sulfhydryl,T-SH)含量;荧光分光光度法测定GSH含量;用试剂盒检测肝匀浆中谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)和谷胱甘肽-S转移酶(Glutathione S-transferase,GST)活性;RT-PCR法检测谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamyl-L-cysteine Ligase,GCL)基因表达。GlcNAcCys能够提高肝匀浆中T-SH和GSH含量,增强抗氧化酶GR、GST活性,RT-PCR结果显示,GlcNAcCys能够诱导GCL mRNA的表达。GlcNAcCys能够提高肝组织T-SH、GSH的含量,增强GST、GR酶活力,增强肝脏的解毒功能,保护肝脏免受毒性中间代谢物的损伤。GlcNAcCys提高肝组织T-SH、GSH含量的机制与其诱导GCLmRNA的表达有关。     

丙溴磷对二种海洋微藻的GPx活性及GSH、CAR含量的影响

实验以三角褐指藻和青岛大扁藻为材料 ,进行了丙溴磷农药对海洋微藻的抗氧化防御系统成份— GPx(glutatione Peroxidase)活性和 GSH(glutathione)、CAR(carotinoid)含量的影响研究 ,结果表明 ,在丙溴磷胁迫下 ,微藻的 GPx活性呈现下降趋势 ,GSH和 CAR含量也表现为下降趋势 ,并且胁迫的时间越长、胁迫的强度越大它们下降的幅度也越大。因此微藻细胞对抗氧化防御系统的能力被削弱 ,从而可能导致活性氧在体内的过量产生与积累 ,进而对藻细胞造成更大的伤害。