激光扫描共聚焦显微镜在海洋动物发育生物学上的应用

激光扫描共聚焦显微镜具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察等优势。本文扼要介绍了激光扫描共聚焦显微镜的原理和特点,着重阐述了激光扫描共聚焦显微镜在海洋动物配子发生;受精过程中细胞内Ca~(2 )变化、肌动蛋白转移和蛋白激酶变化;胚胎和幼体发育的三维成像等研究领域中的应用。并对LSCM在DNA含量、RNA含量等领域的定量、定性前景进行展望。     

三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析

为了研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)HMGR基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:KF280756)。该序列全长2575bp,包括一个53bp的5′端非编码区,一个686bp的3′端非编码区和一个长度为1836bp的开放阅读框,编码611个氨基酸。该氨基酸序列与已公布的美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列相比一致性达65%,具有Ⅰ型HMGR保守催化区域、两个HMG-Co A结合基序和两个NADP(H)结合基序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析三疣梭子蟹HMGR基因的组织差异表达及在蜕皮周期中的表达水平变化,结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹大颚器(MO)中的表达量最高,在其它组织中表达量均极低;在三疣梭子蟹蜕皮周期中,大颚器中HMGR基因的表达量自A期至D0亚期升至最高,然后下降,至D4亚期最低。验证了大颚器是三疣梭子蟹合成甲基法尼酯的唯一器官,表明HMGR在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵子发生、激活与早期卵裂的细胞学观察

采用连续切片和光镜技术,对三疣梭子蟹卵子发生、激活和早期卵裂进行了细胞学观察.结果表明,在发育及再发育的卵巢中,三疣梭子蟹卵子发生主要经历了卵原细胞的增殖和初级卵母细胞的分化、生长、成熟这两个阶段.依据卵子发生过程中雌性生殖细胞形态的变化,这两个阶段又可细分为卵原细胞期、卵黄发生前卵母细胞期、小生长期、大生长期、近成熟卵母细胞期和成熟卵母细胞期等6期.成熟卵母细胞处于第一次减数分裂中期,这可作为卵子成熟的形态学标志.第一次减数分裂中期纺缍体长轴的旋转可以发生于卵巢中,与精子及海水的刺激无关.初级卵母细胞达到形态和生理上都成熟的时间窗口很窄.精子入卵引起卵子的激活和减数分裂的完成.23℃下离体培养时,第一和第二极体分别在卵产出后约40min和2h释放.雄原核的形成早于雌原核.雌、雄原核在卵产出后约5h通过联合形成合子核.卵产出后约6h,受精卵处于第一次核分裂后期,但卵裂沟直到卵产出后13h才能观察到,此时核已完成了2次分裂,形成合胞体胚胎.     

东方扁虾卵巢和滤泡结构的研究

卵巢包括4种形态的组分:(1)卵巢壁,(2)生殖上皮,(3)卵母细胞(早期卵巢还包括卵原细胞)一滤泡细胞层,(4)卵巢壁内突.卵巢壁及壁内突均含有血管、血窦、肌细胞等成分,卵巢壁内突延伸至每个滤泡的外层基膜处.滤泡由内至外由卵母细胞、卵周隙、滤泡细胞及基膜等4部分组成.卵母细胞膜表面向卵周隙内伸出许多微绒毛,并具有许多微吞饮凹.随着滤泡的发育,卵周隙内含物电子密度越来越大,成熟滤泡的卵周隙内含物演变为卵壳.卵壳由两部分构成:外层较薄,而内层较厚且含电子致密的颗粒物质.滤泡细胞一般为单层,具较强的合成活性,其合成产物系卵周隙内含物的一部分.东方扁虾卵巢和滤泡的结构特征表明外源性(卵母细胞外及卵巢外)的卵黄合成在卵黄发生上起重要的作用.     

三疣梭子蟹精子保存研究

于2004年5月到2004年7月对三疣梭子蟹精子进行了常温、低温和超低温保存研究。利用离子载体A23187人工诱导顶体反应以判断精子活力。常温和低温保存实验的结果显示,4℃下无钙人工海水(calcium-free artificial sea water,Ca2 FASW)保存236h的精子有25%以上的成活率。在4℃,25℃两种温度与Ca2 FASW、天然海水(natural sea water,NSW)两种基础液构成的4种组合中,最优组为4℃、Ca2 FASW,最差组为25℃、NSW。将精子浓度与Ca2 FASW对照组及诱导组比较,结果显示,25℃和4℃下,精子浓度与对照组顶体反应率相关性不显著(P=0.068>0.05,P=0.265>0.05),与诱导组顶体反应率极显著相关(P<0.01)。以二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和甘油(Glvcerol,G)作为抗冻剂进行超低温冷冻实验,72h后解冻,包括对照组在内的所有组均有98%以上的精子不经诱导就发生顶体反应。     

龙虾类叶状幼体的培养

简要回顾了龙虾类叶状幼体培养研究的历史,着重综述了影响叶状幼体培养成功的因素,并就实现叶状幼体培养的可能途径进行了初步的探讨。     

东方扁虾繁殖生物学特征的调查研究

对雌雄异体受精的东方扁虾的性腺发育，交配，排卵，抑卵孵育及孵化等繁殖习性进行了初步调研，同时也对闽南海区东方扁虾若干繁殖生物学参数进行了研究，结果表明：东方扁虾抱卵季节为3月初至10月中旬，高峰期是3月中锂至4月中锂，东方扁虾头甲长与体长之间的关系显示了雌雄二态现象，这一现象明显地与产卵特征相关联，抑卵雌虾的抑卵量（N）与体长呈曲线相关：N＝12.039(体长）^1.4813(r^2=0.7742)，东方扁虾在一年内可多次排卵，抱卵，卵径平均范围为0.96-1.29mm,卵重平均范围为0.575-1.000mg,卵径和个卵重都随胚胎发育的进展而增大。