一株海绵附生芽孢杆菌的抗硅藻附着活性成分的分离鉴定

为寻找天然抗污损活性化合物,以抗硅藻附着活性为导向,采用有机溶剂萃取、半制备高压液相色谱对分离自海绵的芽孢杆菌UST050418-715代谢产物进行分离,纯化抗硅藻附着活性物质,并利用气相色谱-质谱联用仪、核磁共振波谱分析活性物质结构。从菌株UST050418-715代谢产物中分离得到7种具有抗硅藻附着活性的环二肽类化合物,分别鉴定为:(1)环(L-亮氨酸-反式-8-羟基-L-脯氨酸-)、(2)环(L-缬氨酸-L-脯氨酸)、(3)环(D-脯氨酸-L-亮氨酸)、(4)环(L-脯氨酸-D-亮氨酸)、(5)环(甘氨酸-L-脯氨酸)、(6)环(L-苯丙氨酸-顺式-8-羟基-D-脯氨酸-)、(7)环(L-苯丙氨酸-反式-8-羟基-L-脯氨酸-)。说明海绵附生芽孢杆菌UST050418-715代谢产物中存在大量环二肽类化合物,可以帮助宿主海绵实现对硅藻附着的化学防御。     

3种处理对纤细角毛藻生长及细胞生化组成的影响

纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)是海水养殖育苗过程中重要的饵料生物,其生长速度和营养成分组成对育苗的效率和质量都有重要意义.本研究通过单因子试验研究了温度、盐度和超声波3种处理方式对纤细角毛藻生长、蛋白质和总脂占比的影响.结果表明,温度和盐度都显著影响纤细角毛藻的生长,5~40 min的超声波处理不影响纤细角毛藻的生长;纤细角毛藻生长的最适条件是温度为25℃,盐度为25;3种处理方式对纤细角毛藻的蛋白质和总脂占比都有显著影响,其中超声波处理影响最显著,短时间处理(5 min)能使蛋白质占比达到最高值,长时间处理(40 min)能使总脂占比达到最高值.本研究的实验结果可以作为饵料微藻二段培养所采用条件的参考依据.     

一株抗硅藻附着的海绵附生菌的鉴定及发酵条件优化

为了从海绵共附生微生物中寻找天然高效抗污损活性物质,本文针对前期研究获取的4株具有显著抗硅藻附着的活性菌株进行活性验证和比较,选出其中最优菌株进行菌种鉴定及发酵条件优化.比较了活性菌株对小新月菱形藻(Nitzschia closterium)、咖啡双眉藻(Amphora coffeaeformis)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)附着的抑制活性,确定菌株UST050418-715为最优菌株;通过16S r DNA的测序分析,结合平板的菌落形态和扫描电镜下菌体特征,鉴定活性菌株UST050418-715为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus).为优化该菌株的培养条件,选择了酵母粉、蛋白胨、Na Cl、p H值进行四因素三水平的正交实验,对菌株培养条件进行优化.发现选择的4个因素对应的菌株发酵产物对硅藻附着的抑制活性大小不同,影响显著性顺序是酵母粉蛋白胨Na Clp H值,综合菌株发酵产物活性、粗提物产量和菌株生长情况进行分析,确定菌株UST050418-715基于海洋2216E培养基的最佳发酵条件为:蛋白胨含量7.5 g/dm3,酵母粉含量3 g/dm3,Na Cl含量10.45 g/dm3,p H值9.5.     

几种海洋抗污损化合物的单一与联合毒性效应评价

本文研究了目前广泛应用的防污涂料毒性添加剂3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea(Diuron)、2-methylthio-4-t-butylamino-6-cyclopropylamino-s-triazine(Irgarol 1051)、triphenylborane pyridine(TPBP)、Zinc pyrithione(Zn-Pt)、Zinc bis(dimethyl thiocarbamate,Ziram)、Cu~(2+)的单一毒性和二元混合毒性.结果表明:对卤虫而言,6种化合物单一毒性按强弱排序为TPBPDiuronZiramCuSO_4Irgarol 1051Zn-Pt,它们对卤虫48 h的LC50分别为CuSO_49.1μg/cm~3、Diuron 8.0μg/cm~3、Irgarol 1051 12.0μg/cm~3、TPBP 0.07μg/cm~3、Zn-Pt 30.9μg/cm~3、Ziram 8.2μg/cm~3.对卤虫的二元联合毒性实验采用混合毒性指数法(MTI)评价,结果显示:共有8个组合具有协同效应,包括Irgarol 1051/Diuron、Irgarol 1051/TPBP、Irgarol 1051/Ziram、Irgarol 1051/Zn-Pt、Irgarol 1051/CuSO4、Diuron/TPBP、Ziram/CuSO_4以及Zn-Pt/CuSO_4.其中Irgarol 1051/Ziram组合的MTI值高达2.740,Zn-Pt/CuSO_4组合更高达5.621.发现8个协同效应组合中有5个和Irgarol 1051有关,表明Irgarol 1051在基于毒性的防污涂料配方中有其良好的适应性,但进入海洋环境的Irgarol 1051具有引起较强生物毒性的环境风险.另有5个组合Diuron/Zn-Pt、Diuron/CuSO_4、TPBP/Ziram、TPBP/ZnPt、Ziram/Zn-Pt表现为一定程度拮抗作用,应在防污涂料配制中尽量避免同时使用.     

一株源自海绵的α-葡萄糖苷酶抑制活性菌的鉴定、培养条件优化及活性物质的分离

为从海洋微生物中获取天然α-葡萄糖苷酶抑制活性(α-glucosidase inhibiting,α-GI)化合物,对一株前期研究发现具有α-GI活性的细菌进行鉴定和培养条件优化,并对其代谢产物进行分离,获取和鉴定其活性化合物。通过形态学观察和16S r DNA测序鉴定活性菌株HY95为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis);采用分析单因素和正交试验选取菌株的最佳培养条件为:2.5%(V/V)的接种量,130 r/min的摇床转速,28℃恒温培养60 h。经优化后的MB培养基中:蛋白胨5.00 g/L,酵母粉1.50g/L、氯化钠9.725 g/L,pH 7.5;以生物活性测试为导向,用化学方法(薄层色谱、高效液相色谱)对其中的活性组分进行分离纯化,并经核磁共振氢谱分析确定得到一个α-GI活性化合为环(苯丙氨酸-酪氨酸),其对α-葡萄糖苷酶的抑制率为53.72%±4.92%。为α-GI活性化合物的筛选提供了一个极有开发前景的途径和来源。     

海绵共附生微生物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的筛选与初步鉴定

通过建立α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型,对美国圣璜岛海域海绵共附生微生物发酵产物进行活性筛选.其中,α-葡萄糖苷酶活性测试反应体系是在96孔酶标板中进行,在α-葡萄糖苷酶浓度为0.008 U/cm3,pH值为6.8,反应温度为37℃及测定生成物波长为405 nm的基础上,优化筛选模型.结果表明,模型的最佳筛选条件:底物PNPG的浓度为10 mmol/dm3、活性测试反应时间为25min,样品溶剂DMSO含量为2%(V/V).以α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖作为阳性对照样品,根据优化后的抑制活性筛选模型对212株海绵共附生微生物的粗提物样品进行筛选.结果表明:19株微生物的粗提物抑制率大于50%;其中,抑制活性最高的5株菌株的粗提物,在浓度为0.4、0.6、0.8 mg/cm3时,其抑制活性均在70%以上,远远高于阿卡波糖的最高抑制率58%(1.6 mg/cm3).其中菌株HY936粗提物浓度在0.4 mg/cm3时,仍具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制率79.3%.通过16SrDNA序列测定与分析,鉴定该菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus).坚强芽孢杆菌代谢产物能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性,这为研制新型α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了有力的线索,对坚强芽孢杆菌有待作进一步的研究.     

硅藻粘附性EPS提取方法的比较研究

底栖硅藻是可见光能照射到的水下表面生物膜中的主要污损生物,胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)是硅藻生物膜形成和发育过程中的关键物质,可溶性EPS和粘附性EPS的提取方法不同,对粘附性EPS的分离提取仍没有统一的方法。本研究选用了4种方法提取底栖硅藻(Amphora sp.)粘附性EPS:30℃水浴处理、70℃水浴处理、福尔马林-NaOH处理和阳离子交换树脂处理,研究了不同分离方法条件下,Amphora sp.粘附性EPS中各主要成分的提取量。结果表明,粘附性EPS中各主要成分普遍受提取方法的影响,其中DNA含量变化幅度最大,其次是蛋白质、总糖和糖醛酸含量,硫酸基含量受提取方法的影响最小。低温水浴处理提取效率低,高温水浴处理可能影响EPS的后续分析,阳离子交换树脂提取粘附性EPS的效果较好,但对细胞的破坏最严重,福尔马林-NaOH处理提取的EPS总量最高,提取总糖、糖醛酸的效果最好,而且没有造成严重的细胞破裂。因此福尔马林-Na OH处理是相对均衡和高效的提取硅藻粘附性EPS的方法。     

抗硅藻附着活性细菌的筛选、鉴定与发酵条件优化

从美国华盛顿州圣璜岛海域的8 种海绵样品的120 株共附生微生物中, 筛选出11 株细菌的粗提物能有效抑制硅藻附着。其中683 号菌株活性最高, 对5 种受试硅藻的平均抑制率达到98.0%。结合形态学特征和扫描电镜观察, 以及16S rDNA 序列分析, 鉴定该菌株为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus。并采用正交试验对该菌株进行发酵条件优化, 结合粗提物的产量和抗硅藻附着活性进行统计学分析,确定了该菌株的最佳发酵条件是: 发酵温度25℃, pH 7.5, NaCl 浓度19.45 g/L, 蛋白胨浓度5 g/L。