中国卤虫早期胚胎发育相关基因的研究--mRNA差异显示技术的三种不同染色方法比较

利用mRNA差异显示技术研究中国孤雌生殖卤虫胚胎发育的相关基因，并对中国孤雌生殖卤虫差异显示中SYBR Green Ⅰ、硝酸银和溴化乙锭三种染色方法进行了比较。以三种单碱基锚定引物对发育0h，4h，8h，12h，16h和10天的中国孤雌生殖卤虫的RNA进行逆转录和26种随机引物进行PCR反应，经非变性的6％聚丙稀酰胺凝胶电泳后，分别用SYBR Green Ⅰ、硝酸银和溴化乙锭染色，最后进行差异条带的回收和再扩增。结果表明：(1)6种样本的DD-PCR产物显示长200-3．0k不等的扩增片段，条带清晰，并呈现出有无和强弱的变化(2)SYBR Green Ⅰ和硝酸银染色的灵敏度比溴化乙锭染色的灵敏度高(3)经SYBR Green Ⅰ和溴化乙锭染色的凝胶的回收和再扩增效率比硝酸银染色的高(4)水煮法和NAP-25过柱法对凝胶片段的回收效果几乎相当。利用mRNA差异显示技术研究中国孤雌生殖卤虫胚胎发育相关基因时，得到了较好的扩增片段；三种染色方法中SYBR Green Ⅰ染色灵敏度较高，并且SYBR Green Ⅰ染色有利于凝胶片段的回收和再扩增。     

中国卤虫(Artemia sinica)早期胚胎发育相关基因表达序列标签(ESTs)分析

以mRNA差异显示技术分析了中国两性生殖卤虫早期胚胎发育相关基因的表达序列标签(ESTs),共回收了2000条差异条带并进行了克隆、测序,在GenBank/DDBJ/EMBL数据库中用BLASTX和BLASTN软件分别与NCBI上的非冗余核酸序列数据库进行同源性比对,得到分值较高、长度在100bp—2kb以内的ESTs序列133条。所发现的133条ESTs的生物学功能分类为:能量代谢占24%、细胞生长、分裂相关基因占23%、RNA相关占17%、体节形成占12%、蛋白质合成占3%、转录因子占3%、离子转运占5%、细胞信号转导占4%、未知占9%。对所发现的ESTs进行了RT-PCR测定,排除假阳性能够提供足够数量的信息用于获取其全长cDNA,进而获得其全长基因序列以用于功能研究。另外,研究发现了包括小热休克蛋白基因家族、Hox基因家族的abdA和Dfd基因、A-trh基因(排盐器官及盐调节基因)、HIF(缺氧诱导因子)、CK-M2(肌肉型磷酸激酶基因)和GRP基因(富甘氨酸蛋白基因)等20个具有明显功能的相关基因的ESTs和完整基因序列和开放阅读框(ORF)。经初步推断这些ESTs和基因的功能大多为与卤虫发育的生理、生化相关的基因有关。所研究的133条ESTs基本代表了卤虫早期胚胎发育相关功能基因的表达谱。