基于LAMP-LFD技术的有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)快检方法

以东海原甲藻的ITS序列(Internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将生物素标记的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增产物与经异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针特异性杂交,并结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)肉眼直接观察检测结果,建立了有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的快速检测技术。经优化后的最适条件为63°C、30min,较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明:LAMPLFD可特异性检出东海原甲藻,对常见赤潮藻检测结果均为阴性;其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL,是常规PCR技术(以F3/B3为引物)的10倍。LAMP-LFD技术能高效、特异地检出东海原甲藻,仪器设备依赖性低,结果可视化,有望成为赤潮原因种检测监控的常规方法。     

五种/株原甲藻核糖体小亚基(18S rRNA)基因克隆及序列分析

采用分子克隆及序列比对的方法,对五种/株赤潮原甲藻18SrRNA基因全长序列进行扩增、克隆和序列测定,并从GenBank上下载13个原甲藻18SrRNA基因接近全长的序列,用NJ法和ME法构建了原甲藻属的系统树。结果表明,五种/株原甲藻18SrRNA基因扩增序列长度为1782—1783bp,其中来自南海(中国海域)和来自美国海域的两株微小原甲藻(Prorocentrumminimum)的序列完全一致;东海的赤潮原甲藻(Prorocentrumsp·)与具齿原甲藻(P·dentatum)的序列也完全一致,与微小原甲藻只有5个碱基的差异;而海洋原甲藻(P·micans)与微小原甲藻和具齿原甲藻的序列差异较大,分别为27个和28个碱基。通过NJ法和ME法构建的系统树基本一致。由系统树可以看到:原甲藻属大致分为两支,本实验的微藻全部分布在同一支上。18SrRNA基因序列还将有助于有害赤潮藻快速鉴定的特异性分子探针的研制。     

东海原甲藻的分子鉴定

采用nrDNAITS序列及18S序列两种分子标记,对东海原甲藻和美国国家海洋藻种保藏中心(CCMP)的具齿原甲藻进行分子鉴定,结果表明,两者之间序列非常相似,两者的nrDNAITS序列碱基差异值仅为0.002,nrDNA18S序列的碱基差异值为0.000,根据分子数据,东海原甲藻和美国国家海洋藻种保藏中心的具齿原甲藻应为同一个种.从基因库获取原甲藻的另外3个种nrD-NAITS序列和8个种的18S序列,用计算机软件进行分析和构建分子系统树,结果显示18S序列用于原甲藻的分子鉴定过于保守,而nrDNAITS更适合于该种属界定的分子标准.     

赤潮异弯藻和海洋原甲藻LSU Rdna扩增及序列分析

利用引物D1R和D2C扩增并测定了赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo Hada)和海洋原甲藻(Prorocentrum micans Ehrenberg)的LSU rDNA D1与D2序列,并与GenBank中相关序列进行比较分析.结果表明:在种内水平,所测的H.akashiwo 6个株系之间共有5个变异位点,序列H.k与H.k-2,H.k-4均存在碱基替换;原甲藻属不同种内各株系之间的遗传距离为0.002～0.023之间,所测序列P.mi与P.micans其他株系之间均存在碱基替换.在种间水平上,原甲藻属不同种之间的遗传距离在0.045～0.139之间,大于种内遗传距离,每个种都具有特定的保守序列.根据序列间的遗传变异,可设计特异性的探针对不同株系和物种进行检测和计数.     

东海原甲藻对中肋骨条藻的他感作用初探

在实验室内将不同生长期的东海原甲藻(Prorocentrum donghaienseLu)培养液滤液用切向超滤技术分级处理后,培养中肋骨条藻(Skeletonema costatum),发现东海原甲藻的滤液对中肋骨条藻的生长具有促进作用,不同生长期的东海原甲藻分泌物在粒级100 ku～0.45μm的培养液中对中肋骨条藻的促进作用最明显,表明东海原甲藻可以产生大小不同的可促进中肋骨条藻生长的他感物质,且在100 ku～0.45μm范围含量较大。东海原甲藻对中肋骨条藻的生长促进作用在不同生长期作用强度不同,促进作用最明显的是消亡期,其次为平台期,指数生长期的藻液是3种藻液中促进作用最小的。     

中国东海和韩国马山湾海域2株原甲藻的形态结构和分子序列比较

对采自我国东海温岭海域和韩国南部马山湾海域的2株原甲藻进行了藻种分离、纯化培养及rDNA ITS分子序列的PCR扩增与测序,并运用显微镜、扫描电镜、Jukes-Cantor距离矩阵及构建的系统发育树,比较研究了2株原甲藻的形态结构和分子序列.结果表明:温岭藻株(LAMB090508)和马山湾藻株(PDKS0206)具有...     

半连续培养下东海原甲藻和中肋骨条藻种群生长过程与种间竞争研究

采用半连续培养方法研究了温度和营养盐(N和P)限制对中国东海2种重要赤潮生物东海原甲藻和中肋骨条藻生长及种间竞争的影响。结果表明,东海原甲藻在20℃和25℃时生长状态良好,具有明显的指数增长期,15℃时细胞生长明显受到影响;中肋骨条藻具有较广的温度适应性,15~25℃时均具有明显的指数增长期。东海原甲藻可以忍受低营养盐环境并种群增长,而中肋骨条藻细胞增长需要较丰富的营养盐。在营养盐充足的环境里中肋骨条藻具有竞争优势,相反,在营养盐限制的环境中,东海原甲藻是竞争的优胜者。实验结果与东海原甲藻赤潮爆发现场的环境调查结果基本一致,可以作为解释东海原甲藻赤潮形成原因的依据。     

一种快速制备甲藻细胞PCR扩增DNA模板的方法

报道了一种快速制备PCR扩增甲藻细胞模板DNA的方法。以赤潮甲藻塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）和链状亚历山大藻（Acatenella）为目标藻，对藻液预处理后直接用于PCR扩增，获得5,8S核糖体RNA基因及其两侧的核糖体RNA基因转录单元内基因间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列片段，成功测序。此方法避免了复杂的DNA提取过程。     

网状原角藻化感作用的初步研究

为明确海洋甲藻——网状原角藻(Protoceratium reticulatum)对海洋微藻的化感作用,揭示其化感物质作为植物源抑藻剂的开发潜能,本文探讨了网状原角藻藻细胞和无细胞滤液对几种海洋微藻——东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、拟旋链角毛藻(Chaetoceros pseudocurvisetus)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)生长的影响,并进一步选取东海原甲藻和赤潮异弯藻作为受体藻种,以塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)作为阳性对照,比较了2种甲藻的藻细胞培养液和无细胞滤液对东海原甲藻、赤潮异弯藻生长的影响差异。通过比较发现,网状原角藻的无细胞滤液比塔玛亚历山大藻能更明显的抑制东海原甲藻和赤潮异弯藻的生长,尤其是对东海原甲藻,基本阻断其生长。     

生物胺对赤潮藻生长的影响作用初探

选取东海赤潮高发区常见的两种甲藻[东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)]和两种硅藻[中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、海链藻(Thalassiosirasp.)],以2-苯基乙胺、腐胺、亚精胺、精胺四种赤潮水体中常见的生物胺为因素,设置0、5、25、100nmol/L四个浓度水平,进行L16(45)正交添加培养实验。根据Logistic生长模型进行曲线拟合,分析得到的生长参数。结果显示,不同的生物胺对各赤潮藻生长影响的大小、趋势均存在差异。其中,2-苯基乙胺对四种赤潮藻的生长影响最显著。高浓度的2-苯基乙胺对中肋骨条藻的生长具有明显的抑制作用,对塔玛亚历山大藻的生长具有明显的促进作用。多胺物质(腐胺、亚精胺和精胺)对甲藻(东海原甲藻和塔玛亚历山大藻)生长的促进作用大于硅藻(海链藻和中肋骨条藻)。多胺中的亚精胺对塔玛亚历山大藻和海链藻的生长影响最大,精胺对东海原甲藻和中肋骨条藻的生长影响最大。多胺可能是2010年东海赤潮由中肋骨条藻向东海原甲藻演替的一个诱导因素,其中精胺可能发挥的作用较大。     

Molecular genetic diversity of bacteria in the bottom section of arctic sea ice from the Canada Basin

PCR-DGGE approach was used to analyze bacterial diversity in the bottom section of seven arctic sea ice samples colleted from the Canada Basin. Thirty-two 16S rDNA sequences were obtained from prominent DGGE bands. The closest relatives of these sequences are found to be those of cultivated or uncultured bacteria from antarctic or arctic sea ice. Phylogenetic analysis clustered these sequences or phylotypes within α- proteobacteria, γ-proteobacteria and CFB (cytophaga-flexibacter-bacteroides) group. Sequences belonging to γ-proteobacteria were dominant and members of the CFB group were highly abundant. It was suggested that the CFB group was the representative of the bottom section of sea ice samples.     

烟台市区河流入海口微生物群落的分析

2015年4月在烟台市区4条主要河流(辛安河、逛荡河、鱼鸟河和夹河)入海口处采集12个样品,利用PCR-DGGE方法分析了此区域的细菌群落组成和优势菌群。通过统计学手段对DGGE图谱进行分析,结果表明4条河流入海口细菌群落丰富度都较高,12个取样点扩增的DGGE条带数都在30以上,样品的Shannon指数均高于3.3,个别甚至可达3.61。其中,辛安河和逛荡河的Shannon指数平均值均高于鱼鸟河和夹河,夹河多样性最低;而且UPGMA聚类分析结果显示地理位置越接近,其细菌组成的相似度越高。在DGGE电泳条带中选取14条主要条带进行扩增和序列测定,所得到的序列进行了系统进化分析发现4条河流入海口的优势菌群主要为变形杆菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。这与近年来关于山东近岸海域细菌多样性的研究结果相符合,为研究和保护烟台市区河口处环境提供科学依据。     

带鱼(Trichiurus haumela)鱼卵DNA的提取及其18S rDNA初步分析

目前应用显微镜技术很难进行鱼卵种类的准确鉴定,本文尝试采用DNA技术开展鱼卵的鉴定工作。以带鱼(Trichiurus haumela)鱼卵为研究对象,采用苯酚-氯仿法提取了其DNA基因组,并采用PCR及克隆测序的方法,对其18S rDNA序列进行了测定与初步分析。结果表明,提取的带鱼(T.haumela)鱼卵DNA基因组片段长度约23kb,PCR扩增片段长度约1.8kb;带鱼(T.haumela)鱼卵18S rDNA与其它已知鱼类的18S rDNA序列具有一定的差异性,可以用其进行带鱼(T.haumela)鱼卵的初步鉴定。     

通过核糖体18S rDNA探讨柳珊瑚分子系统发育关系

通过对南海3种柳珊瑚的18SrDNA序列的测序,结合Genebank中搜索到的其他26种柳珊瑚的18SrDNA序列,构建了NJ和MP系统发育树,结果表明柳珊瑚可分为两个类群,系统树清楚表明了钙轴珊瑚类群的系统发育关系,但未能很好反映全轴珊瑚类群的系统发育关系。钙轴珊瑚类群的系统发育关系较为清晰,其中枝鳃珊瑚科(Dendrobrachiidae)、红珊瑚科(Coralliidae)和拟柳珊瑚科(Paragorgiidae)的遗传关系非常紧密,三爪珊瑚科(Briareidae)、鞭柳珊瑚科(Ellisellidae)和Erythropodiumcaribaeorum分类地位还待商榷,需要选取更多的样品构建系统树才能弄清楚它们准确的分类地位。全轴珊瑚类群的系统关系非常混乱,可见18SrDNA并不能提供有效的遗传信息,这就需要寻求其他遗传标记来解决全轴珊瑚类群的系统关系。     

3个海域沙筛贝遗传差异的DNA分子标记研究

本文运用RAPD（random amplified polymorphic DNA）技术，对3个海域的沙筛贝进行了地理遗传差异分析．结果表明福建东山湾与厦门马銮湾沙筛贝的遗传距离为0．2764，深圳湾与马銮湾沙筛贝的为0．3067，深圳湾与东山湾沙筛贝的为0．3305．这说明马銮湾与东山湾的沙筛贝种群遗传距离较近，而东山湾与深圳湾的沙筛贝种群遗传距离较大．对厦门马銮湾沙筛贝的18S rDNA进行了测序，在基因库上查得同科另外3个种的18S rDNA序列，构建了分子系统发育树，发现沙筛贝与Mytilopsis leucophaeata同源性比较高．     

棕囊藻赤潮原因种的分子鉴定和起源分析

测定了发生于我国东南海域赤潮原因种Phaeocystis sp.及相关种类P.globosa和P.pouchetii 18S rDNA序列,并以Phylip35分析软件构建序列距离矩阵和分子系统发育树图.结果表明,该赤潮原因种与球形棕囊藻P.globosa 18S rDNA序列完全相同,从分子水平鉴定了该原因种为P.globosa.分子系统发育树图表示的P.globosa和P.pouchetii的分化顺序表明,分布于我国东南海域的P.globosa可能是一种本地起源的暖水种.Phaeocystis globosa不同株系的形态差异,可能是适应不同生活环境的结果.根据分子生物学的数据对有害赤潮藻类进行系统发育分析,并设计用于有害赤潮藻快速鉴定的特异性分子探针,对赤潮的监控和防治具有重要意义.     

基于18S和ITS-5.8S rDNA基因序列的白色霞水母(Cyanea nozakii)的分子鉴定与检测

采用通用引物PCR扩增法,测定了辽东湾海域的白色霞水母(Cyanea nozakii)螅状体、碟状体及水母体的18S以及ITS-5.8S r DNA序列,同时利用Gene Bank数据库中已有同源序列对其进行序列分析及系统分析。结果显示,白色霞水母3个个体的18S和ITS-5.8S r DNA序列完全一致。白色霞水母样品的ITS-5.8S r DNA序列与Gen Bank中未知真核生物的序列高度相似(≥99%),推测该物种可能是早期发育阶段(卵、浮浪幼虫或碟状体)的白色霞水母样品。霞水母属不同种间18S r DNA序列经比对后同源序列长度为1709bp,多态位点数33个;比对后ITS1同源序列长度为368bp,其中变异位点203个,简约信息位点数178个,单变异位点21个。基于18S r DNA基因序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0、0.008,而基于ITS1序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0.019、0.284。基于ITS1的种间遗传距离是种内遗传距离的15倍,适合于进行物种鉴定。NJ系统树的结果也表明同种的不同个体各自聚枝,其聚类结果大致与形态分类吻合。研究表明,ITS基因片段在霞水母不同种间变异较大,更适于大型水母种类鉴定、检测及属内种间水平的系统进化研究。     

不同碳源富集的石油烃降解菌群结构的分析

以原油和正十六烷为唯一碳源,从长期受石油污染的环境中富集和分离具有不同功能的石油烃降解菌,并利用平板法和PCR-DGGE法时不同碳源富集到的菌群结构进行分析.结果表明,利用2216E平板从以原油和正十六烷为碳源的富集液中各得到两株菌,分另11为TJ-1、TJ-2和TJL-1和TJL-2,分子生物学方法鉴定结果表明,这4株菌分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)、Oceanobacillus picturaeP和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus).PCR-DGGE分析结果表明,以原油和正十六烷为碳源的富集液中优势菌分别有5种和2种,且2种富集液中的优势菌明显不同.对比PCR-DGGE和平板法分析结果,可以看出PCR-DGGE法能够提供更全面的菌群结构信息.     

10种蟹类18S rDNA 和COⅠ基因序列分析及其分子系统发育研究

应用分子系统发育学的方法,以蟹类18S rDNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)基因序列片段为分子标记,结合形态学特征对10种蟹类的分类地位进行探讨。实验共获得10 条18S rDNA序列,长度为1780~1787 bp,其中A、T, G,C平均含量分别为23.72%, 24.58%,24.52%和27.17%;通过序列对比,发现18S rDNA序列相对保守,只含有1个从88 bp 到130 bp 约 50 bp的高可变区;物种间碱基距离比较小,从0.001到0.017。18S rDNA系统发育树为方蟹总科、沙蟹总科和梭子蟹总科起源于同-海洋蟹类祖先提供了分于生物q证惦,开上火亚N内尔量分别为26.88%.弓蟹科。获得的5条CO Ⅰ基因序列,长度均为709 bp,A、T,G、C平均含量分别为26.88%,37.62%,17.50%和18.00%;COⅠ基因片段变异性高,物种间碱基距离从0.016到0.138。COⅠ基因系统发育树真实地反映了住属各物种之间的进化关系,和传统分类非常吻合,为形态特征相似的姆类鉴定提供了-种快速准确的方法。     

Development of a real-time PCR method for Thalassiosira rotula rapid detection

Gene specific primers and DNA probe were designed based on the sequence of 18S rDNA cloned from the red tide alga Thalassiosira rotula. A real-time fluorescent quantitative PCR (RFQ-PCR) method was developed for quantitative detection of T.rotula. The RFQ-PCR assay data showed that the results obtained with the RFQ-PCR quite good agreement with those with the light microscope (LM) counting method, which suggested that the RFQ-PCR could be a useful method for red tide alga detection.