五种/株原甲藻核糖体小亚基(18S rRNA)基因克隆及序列分析

采用分子克隆及序列比对的方法,对五种/株赤潮原甲藻18SrRNA基因全长序列进行扩增、克隆和序列测定,并从GenBank上下载13个原甲藻18SrRNA基因接近全长的序列,用NJ法和ME法构建了原甲藻属的系统树。结果表明,五种/株原甲藻18SrRNA基因扩增序列长度为1782—1783bp,其中来自南海(中国海域)和来自美国海域的两株微小原甲藻(Prorocentrumminimum)的序列完全一致;东海的赤潮原甲藻(Prorocentrumsp·)与具齿原甲藻(P·dentatum)的序列也完全一致,与微小原甲藻只有5个碱基的差异;而海洋原甲藻(P·micans)与微小原甲藻和具齿原甲藻的序列差异较大,分别为27个和28个碱基。通过NJ法和ME法构建的系统树基本一致。由系统树可以看到:原甲藻属大致分为两支,本实验的微藻全部分布在同一支上。18SrRNA基因序列还将有助于有害赤潮藻快速鉴定的特异性分子探针的研制。     

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和海洋原甲藻APBM(P.micans APBM)的5.8S rDNA及其转录间隔区(ITS)的克隆和序列分析

对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和海洋原甲藻APBM(P．micans APBM)的5.8SrDNA及其转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增、克隆和序列测定，并分析了甲藻属9株赤潮藻(7株从GenBank获得)的系统进化关系。结果表明，海洋原甲藻APBM的ITS片段(含5.8S区)为631bp，东海原甲藻的(含5.8S区)为552bp；东海原甲藻与从GenBank中获得的微小原甲藻相似程度较高，与甲藻属其他原甲藻相似程度较低；本文研究的海洋原甲藻APBM的ITS序列与其他原甲藻相似程度都较低并且在进化树上距离也较远。用ITS1或．ITS2序列构建的系统树与用ITS 5.8SrDNA序列构建的系统树反映的结果基本一致，5.8S区因过于保守似乎不适于构建系统树反映种下的亲缘关系。     

运用PCR-DGGE技术对3种原甲藻18S rDNA部分序列的差异性分析

采用3对特异性引物,对中国近海常见3种原甲藻的18S rDNA的部分序列进行PCR扩增,运用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)对PCR产物进行了差异性分析。结果表明,各对引物具有不同的区分效果,选择包含较多差异碱基的短片段进行扩增,可以对藻种进行更好的区分;PCR-DGGE技术具有较高的灵敏性,不同藻种间即使1个碱基的差异也可以区分开;PCR-DGGE技术可以对3种原甲藻进行区分。     

东海原甲藻cDNA文库构建及尝试性EST分析

东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)是中国沿海频繁发生的大规模赤潮的原因种之一,大规模分离鉴定东海原甲藻功能基因是理解东海原甲藻赤潮形成过程和机理的重要基础。取对数生长期藻体,经微量总RNA抽提、cDNA合成、cDNA扩增和克隆等步骤,构建了东海原甲藻cDNA文库并进行了尝试性表达序列标签分析。从含有约5000个转化子的文库中随机取150个测序,获得126条EST序列。经网上BlastN及BlastX分析,共发现11个是已知功能的基因的标签。这些基因与东海原甲藻生长发育、物质转换和能量代谢相关。     

几株原甲藻核糖体大亚基RNA基因的部分克隆及序列分析

对7株赤潮原甲藻28S rDNA 5'端部分序列进行扩增、克隆和序列测定,并从GeneBank上获取14个原甲藻28S rDNA序列,用NJ法和ME法构建了原甲藻属的系统树,并对序列进行分析.结果表明,7株原甲藻28S rDNA扩增序列长度为950~958 bp,通过NJ法和ME法构建的系统树完全一致.大部分分离自不同海域的同种原甲藻的序列高度保守,而不同种间在序列高变区却有较大的差异.但来自南海海域的海洋原甲藻(Prorocentrum micans)与分离自其他海域的株系序列差异较大,甚至超出了有些种间的差异.由28S rDNA高变区获得的序列,有望成为浮游植物特异性分子探针设计的良好靶区域.     

温度、盐度对具齿原甲藻生长的影响及其与中肋骨条藻的比较

在无菌条件下,单种培养具齿原甲藻以研究温度和盐度对其生长的影响。实验设计了5个温度梯度和6个盐度梯度,并计算了不同培养条件下藻细胞在指数生长期的比生长率。实验结果表明：具齿原甲藻生长的最适温、盐范围分别为22℃和25～31。温度对藻类生长的影响比盐度的要明显得多,而且藻生长的最适盐度有随着温度升高向低盐度偏移的趋势。同时,实验研究了同样条件下中肋骨条藻的生长情况,并与具齿原甲藻进行了比较,以试图探讨东海大规模爆发具齿原甲藻赤潮的原因。     

用双特异探针技术定性定量分析微型原甲藻

针对微型原甲藻核糖体大亚基和小亚基RNA分别设计了大亚基探针(LSU probe)和小亚基探针(SSU probe),发展了对微型原甲藻进行定性和定量分析的双特异探针技术.分析数据表明针对微型原甲藻核糖体大亚基RNA的LSU probe能够特异地将微型原甲藻和其他7种微藻分开,而且检测信号的强弱在一定的范围内与细胞数呈线性关系;由于针对微型原甲藻核糖体小亚基的SSU probe探针由于与具齿原甲藻存在核酸序列一致性,该探针与具齿原甲藻有严重的交叉反应,但未发现与海洋原甲藻和其他藻的交叉反应.另外,研究还优化了破碎微型原甲藻细胞所需的超声时间以及获得探针的特异性所需的S1酶反应温度.本研究为实现对微型原甲藻海水样品的快速准确监测奠定了基础.     

中国东海和韩国马山湾海域2株原甲藻的形态结构和分子序列比较

对采自我国东海温岭海域和韩国南部马山湾海域的2株原甲藻进行了藻种分离、纯化培养及rDNA ITS分子序列的PCR扩增与测序,并运用显微镜、扫描电镜、Jukes-Cantor距离矩阵及构建的系统发育树,比较研究了2株原甲藻的形态结构和分子序列.结果表明:温岭藻株(LAMB090508)和马山湾藻株(PDKS0206)具有...     

6种赤潮甲藻对荧光标记藻类的吞噬行为研究

选取6种在中国沿海广泛分布的赤潮甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)和锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea),采用经5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(DTAF)标记灭活的荧光饵料藻进行投喂,观察目标甲藻是否存在吞噬行为,研究光照、营养盐条件对目标甲藻的吞噬行为的影响。结果发现,链状亚历山大藻能吞噬旋转海链藻(Thalassiosira curviseriata),东海原甲藻能摄食球等鞭金藻(Isochrysis galbana),但其摄食概率非常低,且不受光照和营养盐条件的影响。实验中,未观测到米氏凯伦藻、海洋原甲藻、微小原甲藻和锥状斯氏藻的吞噬行为。在黑暗中培养48-72h后,目标甲藻均出现不同程度的死亡,尤其是东海原甲藻和链状亚历山大藻。虽然东海原甲藻和链状亚历山大藻具吞噬行为属于混合营养生物,但光合自养是目标甲藻获取营养、维持生长最主要的方式。     

东海米氏凯伦藻水华中中华哲水蚤的选择性摄食

提要为评估中型浮游动物选择性摄食对有害藻华发展进程的影响,应用一种新的结合Frost直接摄食法和Landry稀释法的现场培养方法,于2005年4月27日—6月5日在东海有害藻华高发区的6个典型站位进行了中华哲水蚤(Calanus sinicus)对浮游植物和微型浮游动物摄食速率的研究。比较了中华哲水蚤对米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和具齿原甲藻(Prorocentrum dentatum)摄食习性的差异,并评估了其摄食在水华进程中的作用。研究结果表明,中华哲水蚤对有害藻华物种存在摄食选择性和摄食速率的阈值。当自然水体中米氏凯伦藻细胞丰度达到157cells/ml和具齿原甲藻细胞丰度达到981 cells/ml时是中华哲水蚤由偏好趋于排斥摄食的阈值。当自然水体中米氏凯伦藻细胞丰度达到176 cells/ml时,中华哲水蚤对其停止摄食。米氏凯伦藻有害藻华发生区中华哲水蚤对具齿原甲藻的无选择性滤食以及对米氏凯伦藻的排斥摄食行为,影响水华进程,最终导致水华物种向米氏凯伦藻方向演替。     

海月水母(Aurelia sp.1)对中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)摄食的研究

采用饵料浓度差减法,在实验条件下研究了不同细胞密度的中肋骨条藻和东海原甲藻对海月水母水螅体、碟状体和水母体摄食活动的影响。结果表明,不同种类和密度的微藻细胞密度对水螅体、碟状体和水母体的摄食有显著影响。在实验的藻细胞密度范围内,随藻细胞密度的增加,水螅体和碟状体对中肋骨条藻和东海原甲藻的摄食率一直升高。水螅体对中肋骨条藻和东海原甲藻的最大摄食率均发生在藻细胞密度最高处,分别为4623cells/(ind.h)和4118cells/(ind.h)。碟状体对中肋骨条藻和东海原甲藻的最大摄食率也是发生在藻细胞密度最高处,分别为174671cells/(ind.h)和47218cells/(ind.h)。清滤率随着藻细胞密度增加而降低。在相似细胞密度下,碟状体对中肋骨条藻的摄食率高于东海原甲藻。水螅体和碟状体对同种藻的摄食情况不同,在相似藻细胞密度下,碟状体的摄食率比水螅体高。经过藻类饵料适应处理的水螅体对藻类的摄食率会有显著增加,约为未经饵料适应处理的10倍。水母体对中肋骨条藻和东海原甲藻未发生摄食。     

剧毒卡尔藻与东海原甲藻间的化感作用研究

为研究剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)与东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)之间的化感作用,在f/2营养盐条件下,分别采用了混合培养及滤液培养的方法。结果表明:剧毒卡尔藻指数生长后期的无藻细胞滤液明显抑制了东海原甲藻的生长,而东海原甲藻滤液对剧毒卡尔藻的生长几乎无影响,化感作用作为重要的影响因素使剧毒卡尔藻获得竞争优势。将剧毒卡尔藻指数生长末期的无藻细胞滤液置于固相萃取(SPE) C18小柱,经吸附、不同比例的甲醇溶液洗脱,考察不同洗脱部分对东海原甲藻生长的影响,发现80%的甲醇洗脱部分明显抑制了东海原甲藻的生长。本研究为了解剧毒卡尔藻的竞争机制提供了重要的科学依据,今后将重点分析剧毒卡尔藻释放的有效抑制东海原甲藻生长的化感物质。     

Blooms of Prorocentrum donghaiense reduced the species diversity of dinoflagellate community

Most of reported harmful algal blooms(HABs)of microalgae(75%)have been caused by dinoflagellates.Studies on the negative effects of HABs have generally focused on animals,valuable organisms in particular,and environmental factors such as dissolved oxygen and nutrients,but relatively fewer on community level,particularly that using metagenomic approach.In this study,we reported an investigation on the effects of a HAB caused by the dinoflagellate Prorocentrum donghaiense on the species diversity and community structure of the dinoflagellate sub-community via a pyrosequencing approach for the samples taken before,during,and after the bloom season of P.donghaiense in the East China Sea.We sequenced partial 28S rRNA gene of dinoflagellates for the field samples and evaluated the species richness and diversity indices of the dinoflagellate community,as a sub-community of the total phytoplankton.We obtained 800185 valid sequences(categorized into 560 operational taxonomic units,OTUs)of dinoflagellates from 50 samples and found that the biodiversity of dinoflagellate community was significantly reduced during the blooming period in comparison to that in pre-and after-blooming periods,as reflected in the four diversity indices:the species richness expressed as the number of OTUs,Chao1 index,Shannon index(evenness),and Gini-Simpson index.These four indices were all found to be negatively correlated to the cell density of the bloom species P.donghaiense.Correlation analyses also revealed that the P.donghaiense cell abundance was correlated negatively with NO3--N,and NO2--N,but positively with total nitrogen(TN)and total phosphorus(TP).Principal coordinates analysis(PCoA)showed that the community structure of dinoflagellates was markedly different among the different sampling periods,while the redundancy analysis(RDA)revealed P.donghaiense abundance,salinity,NO3--N,and SiO32-were the most four significant factors shaping the dinoflagellate community structure.Our results together demonstrated that HABs caused by the dinoflagellate P.donghaiense could strongly impact the aquatic ecosystem on the sub-community level which the blooming species belongs to.     

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)对中华哲水蚤(Calanus sinicus)摄食和消化酶活性的影响

采用单养和混养的方法,在实验条件下研究了东海原甲藻对中华哲水蚤摄食和消化酶活性的影响.结果表明:(1)中华哲水蚤对东海原甲藻存在一定摄食行为,藻类密度对摄食率有明显的影响.实验密度下,中华哲水蚤对东海原甲藻的最大摄食率为930cells/(ind·h).滤水率随着藻密度的增加而呈单一性的下降;(2)混养条件下,中华哲水蚤对金藻和东海原甲藻的摄食率均较单养时下降,滤水率的变化与摄食率相似;(3)不同藻密度下,昆布多糖酶活性都明显高于麦芽糖酶和纤维二糖酶的活性,而麦芽糖酶活性又稍高于纤维二糖酶的活性.与金藻相比,东海原甲藻实验组中华哲水蚤3种消化酶活性明显升高(P<0.05).     

基于18S和ITS-5.8S rDNA基因序列的白色霞水母(Cyanea nozakii)的分子鉴定与检测

采用通用引物PCR扩增法,测定了辽东湾海域的白色霞水母(Cyanea nozakii)螅状体、碟状体及水母体的18S以及ITS-5.8S r DNA序列,同时利用Gene Bank数据库中已有同源序列对其进行序列分析及系统分析。结果显示,白色霞水母3个个体的18S和ITS-5.8S r DNA序列完全一致。白色霞水母样品的ITS-5.8S r DNA序列与Gen Bank中未知真核生物的序列高度相似(≥99%),推测该物种可能是早期发育阶段(卵、浮浪幼虫或碟状体)的白色霞水母样品。霞水母属不同种间18S r DNA序列经比对后同源序列长度为1709bp,多态位点数33个;比对后ITS1同源序列长度为368bp,其中变异位点203个,简约信息位点数178个,单变异位点21个。基于18S r DNA基因序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0、0.008,而基于ITS1序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0.019、0.284。基于ITS1的种间遗传距离是种内遗传距离的15倍,适合于进行物种鉴定。NJ系统树的结果也表明同种的不同个体各自聚枝,其聚类结果大致与形态分类吻合。研究表明,ITS基因片段在霞水母不同种间变异较大,更适于大型水母种类鉴定、检测及属内种间水平的系统进化研究。     

盐度胁迫下中肋骨条藻和东海原甲藻的生长及内源多胺含量的变化

在实验室内不同盐度梯度下培养常见的两种赤潮藻——中肋骨条藻(Skeletonema costatum s.l.)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense),根据logistic生长模型获得了终止生物量Bf和最大生长速率μmax,并测定了藻体中过氧化物酶(POD)、二胺氧化酶(DAO)、多胺氧化酶(PAO)的活性和丙二醛(MDA)、腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)的含量。结果表明,高、低盐度胁迫下,两种藻均会积累MDA,活性氧自由基的伤害增强,藻的生长受到了抑制。同时,两种藻都会提升多胺含量,通过多胺的调节作用来缓解胁迫的伤害,促进生长,但是在提升的多胺种类和形态上,两种藻存在着差异。高盐胁迫下,中肋骨条藻会提升多胺尤其是游离态多胺的含量来缓解伤害,东海原甲藻则依靠结合态的亚精胺和游离态的精胺的调节作用。低盐胁迫下,中肋骨条藻会提升游离态腐胺的含量,而东海原甲藻体内各形态的多胺都会上升。     

三角褐指藻与东海原甲藻间的他感作用研究

本文主要探究了东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)与三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)之间的他感作用。在实验室模拟条件下,分别研究了添加比例为10%、40%、60%、90%、100%的三角褐指藻无藻细胞滤液的培养基对东海原甲藻生长的影响,以及相同比例的东海原甲藻无藻细胞滤液培养基对三角褐指藻生长的影响。结果表明,低浓度三角褐指藻滤液对东海原甲藻(P.donghaiense)的生长表现为促进作用,高浓度则抑制其生长,因此,不同浓度的三角褐指藻藻液对东海原甲藻生长表现出两种相反的他感作用效果;而东海原甲藻滤液对三角褐指藻(P.tricornutum)的生长没有显著影响,说明东海原甲藻并未对三角褐指藻表现出他感作用。     

东海原甲藻赤潮的垂向发展过程:生物-物理耦合数值模拟

近年来,东海原甲藻赤潮在我国东海近岸海域频繁发生。本研究利用生物-物理耦合模型对发生于2005年的东海原甲藻赤潮进行后报模拟,并对控制其起始与发展的因素展开研究。该模型由东海原甲藻种群动力学模型与多层嵌套的水动力模型组合。通过对比模拟结果与室内实验结果,证实种群动力学模型能够很好地重现东海原甲藻在不同光照与磷营养限制条件下的生长过程,同时能够再现藻细胞内部磷含量及藻类对外部营养盐浓度的影响。耦合模型能够较好地再现模拟海域水动力（见Sun et al.,2016）与东海原甲藻赤潮的时空分布。模拟的赤潮发展过程与此前研究中的观测结果一致,且模拟结果表明模型能够捕捉到赤潮初期种群的次表层孕育现象。随后模拟结果被用于诊断决定赤潮垂直分布的决定性因素,结果表明磷酸盐是控制这一现象的关键因素。同时,表层风场在决定赤潮的分布中扮演着重要角色。模拟结果强调了营养盐限制在东海原甲藻次表层孕育及消散过程中的作用,本文所建立的耦合模型需要进一步优化并应用于其它条件下东海原甲藻赤潮的研究中。     

东海海域典型赤潮水体反射光谱模拟研究

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)是我国东海海域的典型赤潮藻种,其在水体中通常呈垂直非均匀分布,并存在季节性和日内的垂直迁移现象。本文通过量化垂直迁移过程中东海原甲藻的分布状态,利用Hydrolight软件数值模拟各状态下的水体反射光谱,研究其光谱特征和变化规律。利用叶绿素浓度高斯垂向模型表征东海原甲藻在水体中的垂直分布,结合东海近岸海域二类水体的生物光学模型,模拟得到垂直迁移过程中东海原甲藻赤潮水体的反射光谱。对比分析叶绿素浓度垂向分布参数(背景叶绿素浓度、甲藻主体水层厚度、水体总生物量和叶绿素浓度峰值深度)对水体反射光谱的影响。研究结果表明,在东海原甲藻从次表层向表层垂直向上迁移过程中,水体反射光谱数值在蓝绿波段(400—570nm)减小,在黄红波段(570—720nm)增大,特别是在叶绿素荧光效应波段(680nm)处的变化尤为明显。     

东海原甲藻抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立

通过制备针对东海原甲藻细胞破碎物的多克隆和单克隆抗体,建立了基于双抗体酶联免疫分析定量检测东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的检测方法。利用该方法对单一藻种、混合藻种和现场样品中的东海原甲藻进行检测的结果与镜检结果相一致,最低检测限度为1×103 cells/m L。该方法的建立对中国近海赤潮暴发的实时监控具有重要意义。