基于RNA-seq技术的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)不同组织转录组比较分析

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是我国重要的淡水虾养殖品种,为探讨罗氏沼虾不同组织基因表达差异,本研究使用Illumina Hiseq平台分析了罗氏沼虾的7个组织(眼柄、肝脏、卵巢、鳃、心脏、肌肉、精巢)转录组,质控后获得高质量的clean reads 36325476、56796932、36328098、51370140、45010606、43240160、42404294条,共计46.2 Gb的clean reads数据。测序结果经denovo组装共获得95220个Unigenes,每个Unigenes的平均长度为1064.9bp。经过生物信息学方法与五个数据库(NR, GO, COG, KEGG, SWSS-PRO)比对,共注释到20368个Unigenes。其中GO功能注释将Unigenes分为生物过程、细胞组分和分子功能3个大类50个分支;在与COG数据库比对中,共有15798条比对到了同源序列,且一共被分为25类;KEGG代谢通路包括6大类33个小类,可将Unigenes映射到330条代谢通路中。分子标记筛选后获得37751个潜在SSR位点,共发现3228575个SNP位点。本研究通过对罗氏沼虾7个不同组织进行转录组测序,数据组装及功能注释,为进一步深入挖掘和开发利用罗氏沼虾功能基因提供参考。     

对虾microRNA的最新研究进展

miRNA(microRNA)是一类广泛存在的长度约为18~25nt(nucleotides)的单链非编码小RNA。它在转录后水平通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻译来调控靶基因的表达,在生物的生长、发育、代谢和免疫等多种生命活动中发挥重要作用。对虾miRNA的研究起步较晚,但近6年来取得了突飞猛进的进展。本文综述了对虾miRNA的发现与鉴定、作用机制及其生物学功能方面的研究概况,并对对虾miRNA的研究前景进行了展望。     

链状亚历山大藻不同生长状态差异表达microRNA的筛选和验证

从链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)延迟期、对数期2个小RNA文库中选择了2个差异表达的microRNA(osa-miR2876和rgl-miR5139),设计f/2培养下延迟期、对数期和高氮、高磷、高锰对数期5个条件,用qPCR的方法对其表达进行了检测。研究建立了以5.8srRNA为内参基因,以SYBR Green I为荧光染料,用加尾法荧光定量PCR检测microRNA在不同生长状态相对表达的方法。microRNA的表达量在对数期和诱导下对数期均低于延迟期,高锰条件下对数期均为最低,且延迟期的表达量分别是高锰条件表达量的18.63和14.12倍。microRNA负调控靶基因的表达,而osamiR2876和rgl-miR5139在对数期均为下调表达,说明其靶基因参与的细胞生理过程:DNA复制、修复、嘌呤、嘧啶碱基的代谢、RNA聚合酶的代谢等过程呈现激活状态,而上述生理过程的激活均有利于藻细胞增殖。这些结果表明:osamiR2876和rgl-miR5139可能在链状亚历山大藻的快速分裂和增殖中发挥着非常重要的调控作用。本文研究结果为甲藻兼性营养型正确性提供了进一步的证据,同时rgl-miR5139在细胞快速生长阶段的下调表达提示在该阶段下异养营养型可能占优势。本研究说明了microRNA在链状亚历山大藻快速生长过程中可能发挥着重要的调节作用。也为其他物种microRNA的研究和检测提供了快速简便、特异性好的研究方法。     

五氯苯酚暴露致花鲈(Lateolabrax japonicus)肝脏损伤的转录组分析

为了探明五氯苯酚暴露后花鲈(Lateolabrax japonicus)肝脏的损伤变化,本文利用Illumina Hi SeqTM2000测序技术对不同浓度五氯苯酚(0,0.1,1.0,10.0,100μg/L)暴露后花鲈肝脏组织进行了转录组测序。经Trinity软件拼接,得到clean reads共247914284条,获得53716条基因。对照不同浓度暴露组和对照组的转录组测序结果,获得共有的差异性表达基因135个,特异性的差异基因数分别有127—819个不等,差异蛋白表达数量随着受试浓度的升高而上升。经BLAST搜索,其中有21459、26464、18896、12403、17262和19159条分别注释到Swiss-prot、Nr、Pfam、KEGG、KOG和GO数据库。KEGG代谢通路分析结果显示获得的差异基因分别映射到6大类141条通路,这些差异表达基因在与环境信息进程相关的信号传导和与组织系统相关的免疫系统的通路中富集最多。KOG数据库预测和分类表明16571条基因归属于25大类,参与一般功能预测和信号传导机制的数量最多,参与翻译后修饰、蛋白质转换与分子伴侣路径的也占较大比例。总体来看,在受到五氯苯酚类物质胁迫后,花鲈体内的信号传导系统首先发生响应,导致机体出现紊乱。污染物暴露后,花鲈机体的应对机制尚待深入分析。     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。     

雌、雄弓背青鳉(Oryzias curvinotus)肝脏转录组比较分析

为发掘弓背青鳉(Oryzias curvinotus)肝脏功能基因、开发环境检测标记基因,本研究采用RNA-Seq技术分别测定了性成熟雌、雄弓背青鳉肝脏转录组,并获得80095044和87043984条clean reads,合并拼接出49912个unigenes(N50=2394bp)。基因表达差异分析显示在雌、雄弓背青鳉肝脏组织中存在571个差异基因(DEGs),其中364个在雄鱼中高表达,207个在雌鱼中高表达。GO和KEGG分析表明差异基因主要参与激素合成、免疫反应、氧化还原反应及卵黄发生等生物学过程。进一步,在转录组中筛选到了多个环境雌激素相关标记基因(vtgs,chgs,er,cyp450等),且这些基因在雌鱼肝脏中的表达水平显著高于雄鱼。研究结果丰富了弓背青鳉的基因资源,为研究基因功能提供了数据,也有助于进一步研究鱼类肝脏在不同性别之间的功能。     

新月细柱藻的分离培养及形态和分子鉴定

自胶州湾分离培养2株微藻(MGB0401和MGB0402)。经形态学鉴定为新月细柱藻(Cylindrotheca closterium)。MGB0401和MGB0402的18S核糖体RNA基因(rDNA)扩增片段长度为1775 bp,存在10个碱基差异。MGB0401和MGB0402的rbcL基因扩增片段长度为1190 bp,有45个碱基差异,对应的氨基酸序列存在4个氨基酸残基差异。系统学分析表明,2株微藻与已知新月细柱藻相应序列亲缘关系最近。微藻常用系统学分析用基因的序列不仅是分类鉴定的补充指标,也是不同研究结果相互比较的重要基础。     

病毒感染海洋球石藻Emiliania huxleyi的转录组分析

海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒E. huxleyi virus (EhVs)在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用，也是开展真核生物病毒–宿主相互作用研究的良好模型系统之一。为了探究病毒感染条件下E. huxleyi基因表达水平的变化，以海洋球石藻E. huxley–BOF 92及其专一性裂解病毒EhV-99B1为研究对象，利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术，分别对E. huxleyi病毒感染组(Exp)和非感染对照组(Con)6 h和45 h的藻细胞样品进行转录组测序分析。共得到32 909条平均长度为1 153 bp的基因。病毒感染6 h和45 h分别得到2 617和5 229个差异表达基因，其中共差异表达基因465个。随机选取10条差异表达基因，采用qRT-PCR进行实验验证，结果证实转录组分析可靠。GO功能注释和KEGG通路富集，发现大量基因与氧化应激反应、脂类代谢、碳水化合物代谢及信号转导等代谢过程相关，其中变化最显著的是谷胱甘肽代谢途径。从病毒感染球石藻转录组中筛选出部分与氧化应激反应相关的基因，其中9个基因显著上调，11个基因显著下调，表明宿主能够通过体内的氧化应激反应响应病毒胁迫。     

鬼手海葵(Aiptasia pulchella)白化恢复后的基因表达差异

海葵白化是由于海葵失去体内共生的虫黄藻和(或)共生的虫黄藻失去体内色素而导致海葵变白的生态现象。为探究鬼手海葵(Aiptasia pulchella)白化和白化恢复后相关的分子机制, 本研究对海葵进行慢性热胁迫处理, 以白化海葵和白化恢复后的海葵为研究对象, 采用2代IIlumina Hi-seq测序技术进行转录组测序, 探究两者在基因表达水平方面的差异变化, 分别获得50109686和43163786条Clean reads, 注释后获得24565和24157个Unigene。比较转录组分析结果显示, 白化海葵与白化恢复后的海葵之间存在214个差异表达基因, 其中白化海葵的高表达基因有101个, 白化恢复后海葵的高表达基因有113个, 这些差异表达基因主要与DNA复制、新陈代谢、离子转运和胶原蛋白有关。对不同处理所涉及的全部28050个表达基因进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA), 结果发现, 白化海葵在胶原蛋白和离子转运方面显著富集表达, 白化恢复后的海葵在核酸修复方面显著富集表达, 推测这些生物学过程在海葵白化和白化后修复过程中发挥重要作用。本研究获得的转录组数据和研究结果初步揭示了海葵共生体系在共生失衡后进行适应性调节的分子机制, 为海葵及珊瑚共生体系应对环境变化的适应性机制研究提供了理论依据。     

三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究

本文采用 PCR扩增和序列测定等技术 ,对三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)线粒体DNA1 6Sr RNA和 COI基因片段进行了初步研究。经 PCR扩增和序列测定 ,分别得到 1 6Sr RNA和 COI2个基因片段的碱基序列 ,其中 1 6Sr RNA基因片段的大小为 566bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 35.1 6% ,34.45% ,1 2 .37%和 1 8.0 2 % ;COI基因片段的大小为 658bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 36.63% ,2 6.44% ,2 0 .52 %和 1 6.41 %。在 2种基因片段中 ,AT含量均明显高于 GC含量 ,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的 1 6Sr RNA和 COI基因片段研究结果相似。通过对三疣梭子蟹 1 6S r RNA和 COI2个基因片段遗传特征的研究 ,发现其种内变异较低 ,在 3个样本中 1 6Sr RNA基因片段序列完全一样 ,COI基因片段中也只有 2个 T/ C位点转换。另外 ,比较本研究所得序列与 Gen Bank中梭子蟹科 5个属的 1 6Sr RNA基因片段序列后 ,发现其聚类结果与传统分类相一致。     

溶藻弧菌体外刺激泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞后早期转录组研究

泥蚶(Tegillarca granosa)是我国传统养殖贝类,细菌性疾病导致的死亡已成为制约泥蚶养殖业发展的重要因素,血细胞是泥蚶免疫防御的执行者,血细胞能直接吞噬异物,能通过包囊作用将异物包裹,血细胞还在炎症反应和伤口修复中发挥作用。采用RNA-seq测序技术研究了溶藻弧菌体外刺激后泥蚶血细胞3h和6h时转录组动态变化,与未受刺激血细胞相比,3h时1790个基因表达发生显著改变,包括1319个上调基因和471个下调基因;6h时3183个基因表达发生显著改变,包括2629个上调基因和554个下调基因。KEGG通路富集分析发现溶藻弧菌刺激后免疫相关多个信号通路或生物学过程发生显著改变,如吞噬体、细胞凋亡、蛋白酶体、内质网加工、局部黏附等。部分免疫相关基因表达丰度3h时变化不显著而6h时发生显著改变,部分免疫相关基因3h和6h时表达丰度均显著改变。研究结果为泥蚶血细胞早期免疫反应提供了新的见解,为泥蚶抗病机理研究提供了理论基础。     

Generation and analysis of expressed sequence tags from the salt-tolerant eelgrass species, Zostera marina

Zosteramarina, a monocotyledonous angiosperm, is one of themost important seagrass species. To investigate the salt-tolerancemechanismand discover salt-tolerant genes in Z. marina, a cDNA library was constructed. Single-pass sequencing of the 5' ends of 4 081 clones yielded 4 002 high quality expressed sequence tags (ESTs), which were assembled into 241 contigs and 1 673 singletons, representing 1 914 unigenes. The average length of the ESTs was 582 bp, with sizes ranging from100-1 500 bp. Basic Local Alignment Search Tool (BLASTX) analysis revealed that 1 664 unigenes had significant homology to known genes in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) non-redundant (nr) database (E-value≤5-10). Among them, the twomost abundant genes encoded metallothionein (157 ESTs) and chlorophyll a/b-binding protein (38 ESTs), accounting for 7.1% and 1.7% of the total ESTs, respectively. Using Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), 1 462 unigeneswere assigned to 1 161 pathways (E-value≤5-10). A total of 938 unigenes were assigned Gene Ontology (GO) terms based on the GO hierarchy analysis, and InterProScan searches recognized 1 003 InterPro families. Three genes formetallothionein in Z. marina that belonged to Class II was identified. Results of this study will improve understanding of the molecular mechanisms of saline tolerance in Z.marina.     

青蛤(Cyclina sinensis)cDNA文库构建及免疫相关因子基因的筛选

在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础.     

4种壳色蛤仔TYR基因的表达特性研究

为了解色素控制基因与壳色的关系,本实验用荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术分析了酪氨酸酶基因(Tyrosinase,TYR)在菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)4种壳色蛤仔和7种组织中的表达特性。结果表明,酪氨酸酶基因在鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、内脏团、水管和唇瓣中均有表达,其中外套膜中表达量较高,其次为鳃,在闭壳肌中表达量最少。不同的酪氨酸酶基因在4种壳色的表达量不同,酪氨酸酶基因TYR2、TYR3、TYR6和TYR9在白斑马蛤中表达量居高,且与斑马蛤和白蛤差异显著(P0.05)。TYR2、TYR6和TYR10在橙蛤中表达量最高,推测与橙色形成有关。TYR11在斑马蛤中表达量最高,且与白蛤和白斑马蛤差异显著(P0.05),推测与背景色形成有关。系统发育分析结果表明,TYR3与马氏珠母贝(Pinctada martensii)同源性最高为64%。TYR10与加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)同源性最高,为53%。与长牡蛎进化关系最近。     

海州湾中国毛虾(Acetes chinensis)种群生物学特征和资源开发状态研究

为掌握我国限额捕捞物种海州湾中国毛虾(Acetes chinensis)的资源动态,于2020、2021年6～7月分别采集了1 094、1 700尾中国毛虾样本,测定其体长、体质量和性别等特征,并运用FiSATⅡ软件对生长、死亡参数及资源利用水平等进行评估。结果显示:2020、2021年限额捕捞期间其平均体长分别为32.30、35.73 mm,雌雄性比分别为1.52︰1、1.62︰1,体长大于35 mm的毛虾中雌性比例分别为98.5%、90.0%,并得出了体质量-体长关系式;2020、2021年自然死亡系数(M)分别为0.55、0.61 month^–1,捕捞死亡系数(F)分别为0.62、0.27 month^–1;2020、2021年开捕体长(L_c)分别为26.28、29.73 mm,均小于最适开捕体长(L_opt) 33 mm;2020、2021年资源开发率(E)分别为0.53、0.31,均小于当年E_0.1 (0.60、0.77),表明海州湾中国毛虾资源尚未过度捕捞。鉴于我国实施...     

砗蚝(Hippopus hippopus)的人工繁育

于2016年4—9月开展了砗蚝(Hippopus hippopus)人工繁育技术研究。采用五羟色胺进行催产、促使配子排放;精卵分别收集,进行异体间受精以避免自交;受精卵经过30h孵化,选出600万D形幼虫进行培育。砗蚝的早期生活史与砗磲(Tridacna spp.)相似,经历前期面盘幼虫、中期面盘幼虫、后期面盘幼虫、足面盘幼虫、单水管稚贝、双水管稚贝、外套膜触手稚贝、幼贝等阶段。与砗磲不同的是,砗蚝怀卵量较少,但卵径较大,D型幼虫也较大,幼虫趋光性更强,壳长2.0mm以后外套膜不伸出壳缘外,幼贝贝壳形态也不同于砗磲。同砗磲幼虫一样,砗蚝幼虫需要构建虫黄藻系统之后,才能出现鳃、次生壳等,从而完成变态成为稚贝。砗蚝幼虫变态率较低,仅为1.4%。中间育成期间,丝状藻和锥形螺是稚贝培育的主要敌害,需及时清理才能确保稚幼贝正常生长发育。经过120d的精心饲育,培养出平均壳长6.3mm幼贝500余个。本研究为进一步开展砗蚝人工繁育、中间育成、增殖放流、资源修复及移植保育提供了参考。     

缢蛏耐高盐性能及其与生长性状的相关性分析

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国重要的水产经济贝类,开展耐高盐新品种选育对平衡不同地区缢蛏良种养殖意义重大。本研究对不同家系缢蛏幼贝进行高盐胁迫,运用统计学方法和相关性分析探究了缢蛏耐高盐性能及其与生长性状的相关性。结果显示,缢蛏家系间壳长、壳高、壳宽和体质量表型值差异较大,体质量变异系数达15.53%。不同家系对高盐耐受性差异较大,家系间死亡率范围在0~100%。胁迫实验共持续9d,各家系缢蛏首粒死亡时间在第1~9d之间,而且死亡率较高的家系内缢蛏死亡时间离散程度较大,说明不同个体间高盐耐受性差异也较大。缢蛏开始出现大量死亡的时间主要在胁迫后第8d,第9d部分家系死亡率高于80%,说明缢蛏对高盐耐受存在一个阈值,超过该阈值会开始或大量死亡。皮尔逊和斯皮尔曼相关性分析显示,缢蛏存活时间和生长性状为正相关,其中存活时间与缢蛏壳长、体质量相关性均达到显著水平(P<0.05)。缢蛏存活率与体质量、生长速度均显著正相关(P<0.05)。整体而言,壳长较长和体质量较重的缢蛏个体耐高盐性能较强,在高盐环境中具有生长优势。本研究揭示了缢蛏的高盐耐受性及其与生长性状的相关性,为缢蛏耐高盐选育工作提供了重要的参考依据。     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白基因克隆及Cd~(2+)胁迫下的表达分析

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒和金属元素代谢等生理过程。本研究采用RACE技术,克隆获得了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白(RpMT)的全长cDNA序列。RpMT的cDNA全长为570bp,编码75个氨基酸,包含15个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构。采用实时荧光定量PCR技术,分析了两种壳色菲律宾蛤仔(白蛤和斑马蛤)RpMT基因在Cd2+暴露后的表达变化。结果发现:Cd2+急性和亚慢性暴露均可导致两种壳色蛤仔消化腺和鳃组织RpMT基因表达量的显著上调;暴露后两种壳色蛤仔鳃组织RpMT基因表达量的增加幅度均高于消化腺组织,且以白蛤鳃组织基因表达水平的上调幅度较高。上述结果表明,RpMT可能在菲律宾蛤仔抵御Cd2+胁迫过程中发挥了重要作用。