香鱼格留虫(Glugea plecoglossi)环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测方法的建立

我国的养殖香鱼正面临着严重的香鱼格留虫（Glugea plecoglossi）感染。本研究联合运用环介导等温扩增技术（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）的检测技术，建立了快速便捷地检测G. plecoglossi的LAMP-LFD方法。该方法以G. plecoglossi的β微管蛋白基因为检测靶标，在其保守区域设计并筛得6条特异性引物（其中上游内引物用生物素标记），进行LAMP反应，产物再与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的特异性探针杂交，在LFD上进行结果判断。结果表明，LAMP-LFD方法能够特异性地检出G. plecoglossi，对梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌香鱼分离株、杀香鱼假单胞菌，以及香鱼组织等的检测均呈阴性。优化后，LAMP的反应条件为65℃反应45min，与探针杂交的条件为65℃反应5min，加之5min的显色时间，整个检测时程为55min。利用该方法能够检测到2.0fg/μL的含β微管蛋白的质粒DNA，针对G. plecoglossi基因组DNA的检测灵敏度为14.0pg/μL；能够从感染强度达到100个虫体/克的香鱼肝组织中稳定地检测到虫体。该方法可在简单的恒温加热设备（如水浴锅）中完成核酸扩增和探针杂交，无需昂贵的仪器装置。综上，香鱼格留虫LAMP-LFD方法操作便捷、灵敏度高、特异性好、检测快速，而且设备依赖性低，完全适合于基层检测的需求。     

双探针型海底热流计数据解算模型选取

选取适合于双探针型海底热流计数据解算的简化模型，是双探针型海底热流计结构优化的理论基础，对提高海底热流数据解算精度具有重要意义。本文基于脉冲式双探针海底工作的有限元数值模型，对双探针的脉冲加热时间、体生热率、热物性、长度及半径等因素在双探针脉冲法的3个线热源简化模型中所引起的模型误差作了详细的分析和讨论，并以模型误差最小为原则选取简化模型。结果表明：1）脉冲加热有限长线热源（PFLS: pulsed finite line source）模型是双探针脉冲法中较为实用的简化模型，它可消除加热时间和探针长度对介质热物性参数求解的影响；2）在PFLS模型下，探针热导率对待测介质热物性测量的影响可以忽略;而探针间距越大、半径越小及其体积比热容与待测介质越接近，则所求介质热物性的模型误差就越小;在保证温度传感器能有效记录到温度变化的前提下，探针脉冲功率的大小基本不影响介质热物性求解的模型误差。     

应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌

用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。     

臭氧化海水对于弧菌DNA的损伤作用

用琼脂糖电泳法分别检测了臭氧化海水对溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、飘浮弧菌(Vibrio natriegen)菌体内DNA和经碱性裂解法抽提后得到的裸露DNA的损伤作用。结果表明,臭氧化海水对DNA有很强的损伤和降解作用,在电泳图谱上表现为DNA带的加宽和弥散;臭氧化海水对裸露DNA的损伤作用,在电泳图谱上表现为DNA带荧光强度的增强和出现长长的拖尾。     

核酸斑点杂交分析法检测对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)

于１９９５年７月在青岛晨阳对虾养殖场采集患当性流行病的中国对虾样品,提纯ＨＨＮＢＶ并研制了一组地高辛标记的ＨＨＮＢＶ核酸探针。采用核酸斑点杂交方法了此组核酸探针的灵敏度和特异性。结果表明,此组探针检测ＨＨＮＢＶＤＮＡ的灵敏度为６２．５ｐｇ,对４６９ｎｇ病虾胃中的病毒可以检出;此组探针与３．７５μｇ健康对虾组织和２ｎｇ健康对虾ＤＮＡ均无交叉反应,１９９７年,应用此组特异性核酸探针检测了发病虾池对虾及     

几种紫菜种质资源遗传多样性的RAPD分析

用随机多态DNA(RAPD)标记方法对11个紫菜(Porphyra)样品进行遗传多样性检测,从46个随机引物中筛选出27个有效引物,共扩增出282条DNA带,其中多态位点224个,占79．4％。用类间平均链锁法对各样品间的遗传距离进行聚类分析。结果显示,2个条斑紫菜之间的亲缘关系很近,遗传相似系数达98．1％,和坛紫菜的亲缘关系较远;坛紫菜不同样品间的遗传相似系数在75．8％～90．6％之间,表明坛紫菜种质资源具有丰富的遗传多样性,是良种选育的遗传基础。     

中国鲎基因组微卫星富集文库的构建及分析

本研究旨在从DNA分子水平上研究中国鲎(Tachypleus tridentatus)种群遗传多样性及种群结构等相关信息,以期为保护其野生群体种质资源提供科学依据。本研究通过生物素—磁珠富集法筛选微卫星标记,构建中国鲎基因组微卫星文库。基因组DNA经Fast Digest Tru1I酶切后,选取400 bp~1000 bp片段,用生物素标记的(GT)15、(CT)15混合探针与其杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段,纯化后连接PMD19-T载体克隆,构建基因组微卫星文库。从334个阳性克隆中随机选取196个片段大于400 bp的阳性克隆进行测序,共获得127个微卫星序列,其中完美型占69.3%、非完美型占11.0%、复合型占19.7%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到多碱基GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA的重复序列。根据微卫星序列设计选择合成40对引物,结果显示其中3对具有较高多态性,可作为进一步评价中国鲎野生种质资源等遗传信息的有效遗传标记。     

文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交技术的建立

文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)是进化发育生物学研究的重要模式生物,文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交(WFISH,whole-mounted fluorescent in situ hybridization)技术将有助于鉴定文昌鱼胚胎发育过程中具有重要调控作用的功能基因。报告了文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交技术,用以快速灵敏分析特定基因在文昌鱼胚胎发育过程中的时空表达图式。用体外转录合成的地高辛标记文昌鱼FGFR基因的反义RNA探针,检测到FGFR在文昌鱼原肠胚中表达于发生内陷的中内胚层细胞中,而预定发育为外胚层的细胞不表达FGFR。     

裙带菜配子体总RNA提取的比较研究

以裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体为材料对比分析了4种方法,改进SDS法、CTAB法,Trizol试剂盒、RNAiso Reagent试剂盒法提取RNA的质量和纯度,并采用RT-PCR对mRNA反转录,对mRNA的可用性进行了检测.结果表明,两种试剂盒Trizol和RNAiso Reagent及其...     

建立白斑综合症病毒在日本对虾体内潜伏性感染的方法研究

在27℃，pH8．0，盐度33条件下，用套式PCR方法和王证点杂交方法对日本对虾(Penaeus japonicus)体内潜伏性感染WSSV的方法进行了研究。对健康日本对虾注射不同稀释倍数的白斑综合症病毒粗提液，死亡率统计显示注射10^4，10^6倍稀释液组的日本对虾死亡率明显低于10，10^2，10^3倍组，结合套式PCR方法和斑点杂交方法进行病毒检测结果发现，仅10，10^2倍稀释液组斑点杂交和一步PCR结果呈阳性；10^3，10^4，10^6倍稀释液组经二步PCR检测为阳性、斑点杂交呈阴性，该结果为建立或界定WSSV在日本对虾体内的潜伏性感染提供了方法学上的依据。     

Construction of white spot syndrome virus (WSSV) whole genome phage display library

A rebuilt vector pCANTAB 5 EE was obtained by inserting a 34 bp double-stranded oligonucleotide which contained a EcoRV recognition sequence into pCANTAB 5 E. White spot syndrome virus (WSSV) genome DNA was fragmented by sonication to isolate fragments mainly in the range of 0.8~2.0 kb, then the fragments were blunt-ended with T4 DNA polymerase and cloned into the EcoRV site of pCANTAB 5 EE. The primary recombinant clone of the library was 3.0×105. Colony PCR of random selected recombinants showed that the size of the inserts was 0.12~1.77 kb. After the whole library recombinant phages infected Escherichia coli HB2151 cells, the extracellular and periplasmic extracts were dropped on PVDF membranes to perform dot blot, using polyclonal mouse anti-VP24 serum, anti-WSV026 serum, anti-WSV063 serum, anti-WSV069 serum, anti-WSV112 serum, anti-WSV238 serum, anti-WSV303 serum and anti-VP26 serum as the primary antibody, respectively. The results showed that the display library could express the viral proteins.     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。     

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的(CA)15寡核苷酸探针从波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)基因组DNA Bsp143Ⅰ酶切位点的400~1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到73.33%。其中完美型(perfect)类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中,共有28条(31.82%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选,其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析,其中4对引物扩增产物为单态,20对扩增产物呈多态性;20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2~12,平均有效等位基因数为3.5。该波纹唇鱼群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.0782、0.8513、0.5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。     

南海沉积物中有孔虫分子生物学鉴定的初步研究

本文以南海深海表层沉积物中的有孔虫样品为研究对象,提取了样品的总DNA片段,利用特异性DNA探针,进行有孔虫的SSUrDNA扩增,对获得的PCR产物进行克隆,测序及分析,证实确为潜在的有孔虫DNA.进化树分析揭示了研究样品中可能存在的有孔虫种类,该方法的建立为有孔虫壳体的鉴定提供了新的技术手段     

Chromosomal localization of the major ribosomal RNA genes in scallop Chlamys farreri

1IntroductionThe class bivalvia includes many well-knownmarine invertebrate species because they play impor-tant roles in aquaculture.Most cytogenetic studies ofbivalvia have focused primarily on chromosome num-ber and gross morphology(Insua et al.,1998).…