网状原角藻化感作用的初步研究

为明确海洋甲藻——网状原角藻(Protoceratium reticulatum)对海洋微藻的化感作用,揭示其化感物质作为植物源抑藻剂的开发潜能,本文探讨了网状原角藻藻细胞和无细胞滤液对几种海洋微藻——东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、拟旋链角毛藻(Chaetoceros pseudocurvisetus)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)生长的影响,并进一步选取东海原甲藻和赤潮异弯藻作为受体藻种,以塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)作为阳性对照,比较了2种甲藻的藻细胞培养液和无细胞滤液对东海原甲藻、赤潮异弯藻生长的影响差异。通过比较发现,网状原角藻的无细胞滤液比塔玛亚历山大藻能更明显的抑制东海原甲藻和赤潮异弯藻的生长,尤其是对东海原甲藻,基本阻断其生长。     

6种赤潮甲藻对荧光标记藻类的吞噬行为研究

选取6种在中国沿海广泛分布的赤潮甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)和锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea),采用经5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(DTAF)标记灭活的荧光饵料藻进行投喂,观察目标甲藻是否存在吞噬行为,研究光照、营养盐条件对目标甲藻的吞噬行为的影响。结果发现,链状亚历山大藻能吞噬旋转海链藻(Thalassiosira curviseriata),东海原甲藻能摄食球等鞭金藻(Isochrysis galbana),但其摄食概率非常低,且不受光照和营养盐条件的影响。实验中,未观测到米氏凯伦藻、海洋原甲藻、微小原甲藻和锥状斯氏藻的吞噬行为。在黑暗中培养48-72h后,目标甲藻均出现不同程度的死亡,尤其是东海原甲藻和链状亚历山大藻。虽然东海原甲藻和链状亚历山大藻具吞噬行为属于混合营养生物,但光合自养是目标甲藻获取营养、维持生长最主要的方式。     

渤海裸甲藻和链状亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素分析

目的:分析渤海裸甲藻(Gymnodinium sp.)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)的麻痹性贝毒毒素,为渤海天津海域的赤潮研究积累基础数据。方法:通过实验室培养裸甲藻和链状亚历山大藻,选取对数生长期、平台生长期的裸甲藻以及平台生长期的链状亚历山大藻,利用高效液相色谱法(HPLC)对这两种微藻进行麻痹性贝毒(PSP)毒素分析。结果:裸甲藻细胞内不含有麻痹性贝毒(PSP);链状亚历山大藻细胞内含有C毒素和GTX1-4毒素,该微藻每个细胞毒素含量约为10.81 fmol/cell。结论:裸甲藻细胞内虽不含有麻痹性贝毒(PSP),但不能排除其含有其它毒素的可能。链状亚历山大藻细胞内含有麻痹性贝毒(PSP),属于有毒微藻,需要对其进行密切监测。     

赤潮微藻对指状许水蚤生殖、生长和发育的影响

在实验室条件下研究了4种赤潮微藻:中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashi-wo)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)以及赤潮异弯藻不同组分对海洋桡足类指状许水蚤(Schmackeria inopinus)生殖、生长和发育的影响。结果表明:(1)4种赤潮微藻能够显著延迟指状许水蚤的抱卵时间并导致抱卵率的降低(P0.05),塔玛亚历山大藻、东海原甲藻和赤潮异弯藻导致指状许水蚤卵囊发育所需时间和抱卵间隔时间的明显延长(P0.05),与对照组相比差异显著;(2)4种赤潮微藻明显抑制了指状许水蚤的发育过程(P0.05),其中赤潮异弯藻作用最为显著;(3)赤潮异弯藻4种组分:细胞液、细胞破碎液、细胞过滤液和细胞重悬浮液均能够延迟指状许水蚤抱卵时间,降低其抱卵率,同时藻细胞过滤液、藻细胞重悬浮液和藻细胞液显著延长了指状许水蚤卵囊发育时间和抱卵间隔时间(P0.05);4种组分均可对指状许水蚤的发育产生明显影响(P0.05),但只有藻细胞液对其生长影响显著(P0.05)。结果表明,4种赤潮微藻均能对指状许水蚤的生殖、生长和发育过程产生不利影响,进而对其生活史特征和种群数量产生影响。     

两种甲藻对人工海水中胶体磷的利用初探

采用批次培养方法,研究了东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenlla)对胶体磷的生物可利用性,并初步探讨了甲藻利用胶体磷的机制问题.结果表明东海原甲藻和链状亚历山大藻均能利用胶体磷生长繁殖.东海原甲藻在接种11d后细胞密度在无机磷和胶体磷培养基中分别为10.53×107和3.43×107个/dm3.链状亚历山大藻在接种11d后细胞密度在无机磷和胶体磷培养基中分别为39.0×105和28.3×105个/dm3.通过对比细胞密度,胶体磷对东海原甲藻生长的促进作用要低于无机磷的作用;胶体磷对链状亚历山大藻生长的促进作用与无机磷的作用相当.东海原甲藻和链状亚历山大藻在胶体磷源下碱性磷酸酶活性迅速升高,前期均显著高于各自无机磷组的碱性磷酸酶活性,碱性磷酸酶活力最高值分别为0.29和0.30μmol/(dm3·h).初步结果表明,两种甲藻均能通过碱性磷酸酶的降解来利用胶体磷.     

东海原甲藻与塔玛亚历山大藻种群增长过程与种间竞争研究

针对我国东海2种重要赤潮肇事生物东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和塔玛亚历山大藻(Alexan-drium tamarense)进行了种群增长过程和种间竞争的实验研究。结果表明,单种培养时,不同氮磷比对东海原甲藻和亚历山大藻种群增长过程没有明显的影响,但是会影响其最终的细胞密度;在混合培养时,营养盐组成比例不同对东海原甲藻和塔玛亚历山大藻的种间竞争过程有影响,但不会影响其最后竞争结果。竞争物种的细胞起始密度对种间竞争结果有明显的影响,P.donghaiense和A.tamarense的接种细胞密度比为2 000∶100和2 000∶200时,东海原甲藻占优势;当接种细胞密度比为4 000∶400时,塔玛亚历山大藻占优势。     

几种海洋微藻的碱性磷酸酶性质初步研究

对5种海洋微藻产生的碱性磷酸酶的性质进行了初步研究并确定了碱性磷酸酶的测定条件。结果表明,在pH 8.2的环境中,各藻产生的碱性磷酸酶最佳反应温度在40~50℃内,且存在一定差异;40℃下酶促反应恒速时间及米氏常数也有所不同,酶活恒速时间顺序为东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)<强壮前沟藻(Amphidinium carterae)<旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)<中肋骨条藻(Skeletonema costatum)<塔玛亚历山大藻(Al-exandrium tamarense);米氏常数大小顺序为塔玛亚历山大藻<东海原甲藻<中肋骨条藻<强壮前沟藻<旋链角毛藻。碱性磷酸酶测定条件为:温度40℃,反应时间90 min,底物浓度260μmol/L。     

NH_4-N氮源下海洋酸化对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长的影响

本文选取东海原甲藻和米氏凯伦藻,以氨氮(NH_4-N)为氮源,通过增加pCO_2(800和1 500μatm)改变海水的酸化程度,研究海洋酸化对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长以及抗氧化生物酶活性的影响。研究结果表明,海洋酸化对东海原甲藻和米氏凯伦藻的生长均有抑制作用,两种藻的生长速率在酸化条件下均低于正常海水条件。东海原甲藻和米氏凯伦藻的最大氮吸收速率及其与半饱和常数的比值(V_(max)/K_s比率)均随着酸化程度的加深而降低,表明酸化抑制了浮游植物对NH_4-N的吸收。东海原甲藻在三个实验条件下的V_(max)/K_s比率均高于米氏凯伦藻,表明东海原甲藻比米氏凯伦藻有更强的环境适应性。海洋酸化诱导了东海原甲藻和米氏凯伦藻的活性氧(ROS)升高,随着酸化程度加深,抗氧化生物酶—超氧化歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性升高,这说明,海洋酸化对两种甲藻生长的抑制,通过抗氧化酶的活性变化在生理层面对外界环境作出响应,与生长和营养盐吸收过程相对应。     

孔石莼与2 种海洋微藻的胞外滤液交叉培养研究

在实验室条件下,采用海洋大型海藻石莼(Ulva pertusaKjellm.)和海洋微藻青岛大扁藻(Platymonas helgolandicaKylin var.tsingtaoensis)、亚历山大藻(Alexandrium tamarense(Lebour)Balech)的滤液做了交叉培养研究,初步探索藻间的克生机制。试验结果表明,不同温度处理下,2种微藻滤液对石莼生长的影响均有显著的差异。不同温度处理的石莼滤液对青岛大扁藻生长的影响差异显著,而对亚历山大藻生长的影响差异不显著。可以推测:石莼对亚历山大藻的抑制作用很可能是通过细胞的直接接触来完成的;而石莼对青岛大扁藻的抑制作用和两种微藻对石莼的抑制作用主要是通过分泌胞外产物(Extracellular products,ECP)来实现的,至于其它的方式和途径有待于进一步研究。     

两种海洋微藻硝酸还原酶活性测定方法的比较研究

对6种常见海洋微藻的硝酸还原酶活性测定方法进行了初步研究。确立了离体法和活体法的提取(振荡)时间及酶促反应时间,分别为:5 min,30 min(离体法)和6 min,10 min(活体法),并对2种方法进行了对比。结果表明:在本文条件下,离体法较活体法更适于进行塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、强壮前沟藻(Amphidinium carterae)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、新月菱形藻(Nitzchia closterium)和旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)的硝酸还原酶活性的测定;活体法更适于东海原甲藻(Prorocentrum donghainase)硝酸还原酶活性的测定。     

混合培养条件下几种赤潮藻对无机磷源的竞争生长研究

采用批次培养方式,研究混合培养的几种赤潮藻东海原甲藻(PrDrocentrum donghaiense)与中肋骨条藻(Skeletonema costatum)及东海原甲藻与链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)对溶解无机磷源的竞争生长响应.结果表明,在富磷及贫磷的培养条件下,中肋骨条藻的比生长率远超过东海原甲藻,而成为培养体系中的绝对优势种.在东海原甲藻与链状亚历山大藻的混合培养体系中,原甲藻大量死亡,可能存在亚历山大藻对原甲藻的他感作用.培养体系中,碱性磷酸酶活性随藻类磷胁迫而显著升高,可能在后期种群利用代谢有机磷源时发挥重要作用,且在不同培养体系中表现出酶活性大小及状态的差异性,该结果可能影响浮游植物对有机磷源的利用效率.     

不同氮源对微藻增殖的影响

采用室内实验的方式研究了无机氮和有机氮对不同微藻增殖的影响情况。比较了不同氮源(氯化铵和尿素)对纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo Hada)、亚历山大藻(Alexandrium sp．)、隐藻(Chroomonas salina f.adolenscens)4种海洋微藻生长的不同影响。结果表明,有机氮尿素对海洋微藻增殖的影响比无机氮的复杂。由微藻最适生长的氮、磷浓度得到N：P值,讨论了该值对微藻增殖的影响,以及影响N：P值的可能情形。     

甾醇在海洋微藻中的分布研究

对29种(株)海洋微藻进行不充气培养,用Bligh-Dyer法提取总脂,皂化后氯仿和正己烷(体积比为1:4)提取甾醇,BSTFA衍生后用岛津QP2010气相色谱-质谱分析仪进行GC/MS分析.从29种海洋微藻中共检测到47种甾类化合物,鉴定出36种甾醇和一种甾酮.其中,4位无甲基Δ5甾醇在所有的微藻中均有分布,一些高等生物中常见的甾醇如胆甾醇、菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇和褐藻中常见的岩藻甾醇等,在微藻中均有广泛的分布.相对而言,4位无甲基5位饱和甾(烷)醇、4-甲基甾(烷)醇和双羟基甾醇的分布则相对较少,其中许多甾醇如甲藻甾醇、巴夫甾醇、C_27:2(Δ5,22/24Me)和C_28:3(Δ5,7,22/24Me)等,只在一种藻或同一纲的微藻中被检测到,可以作为对应微藻或对应纲微藻的特征甾醇.认为海洋微藻甾醇的研究可以为海洋微藻化学分类学及饵料营养学研究提供重要参考依据.     

具有群体感应系统微藻共栖细菌的筛选及抑藻活性的研究

以从海洋微藻中分离到的206株共栖细菌为材料,采用生物传感器法筛选具有群体感应系统的细菌,根据16SrRNA基因对它们进行了分子生物学鉴定和系统发育学分析。利用气相质谱联用法(GC-MS)检测群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)的种类;采用细胞活体荧光测定方法,研究了这类共栖细菌对微藻生长的抑制作用。结果表明,在分离到的206株微藻共栖细菌中有11株具有群体感应系统,它们分属于3类海洋细菌的系统分支:α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和Gram+细菌,通过GC-MS检测确定11株共栖细菌都含有信号分子C8-HSL,部分含有C6-HSL和C14-HSL,其中9株细菌具有抑藻活性,其代谢产物分别对东海原甲藻、棕囊藻、海链藻和赤潮异湾藻的生长具有不同程度的抑制作用。     

氮限制下链状亚历山大藻DMSP合成与生理变化的研究

DMSP是一种重要的生源有机硫化物,甲藻不仅是海洋浮游植物的重要组成部分,同时也是DMSP的重要生产者,但有关DMSP在甲藻中功能的研究比较匮乏。本文首次在链状亚历山大藻中检测到DMSP产生,研究了氮限制对藻细胞生长、细胞体积、活性氧、光合作用能力和DMSP浓度的影响。结果发现,氮限制能引起细胞生长限制及藻细胞DMSP浓度的显著增加。相关性分析发现,细胞活性氧水平和DMSP浓度之间具有强相关关系(Pearson相关系数=0.83),结合实验室之前氮限制下细胞氧化胁迫状态的结果,提示DMSP在藻细胞中具有抗氧化的作用。另外,氮限制下藻细胞体积的显著增大,光合活性降低,提示DMSP在链状亚历山大藻中可能具有渗透压调节的作用。我们的观察进一步验证了前人的发现。本研究还首次分析了链状亚历山大藻中与DMSP合成相关的基因,结果发现,cad-1和cad-2基因可能都参与了DMSP的合成,但发挥不同的作用。实验结果为在甲藻中深入研究DMSP的功能奠定一定的基础,也为揭示甲藻中DMSP合成相关途径提供参考。     

用双特异探针技术定性定量分析微型原甲藻

针对微型原甲藻核糖体大亚基和小亚基RNA分别设计了大亚基探针(LSU probe)和小亚基探针(SSU probe),发展了对微型原甲藻进行定性和定量分析的双特异探针技术.分析数据表明针对微型原甲藻核糖体大亚基RNA的LSU probe能够特异地将微型原甲藻和其他7种微藻分开,而且检测信号的强弱在一定的范围内与细胞数呈线性关系;由于针对微型原甲藻核糖体小亚基的SSU probe探针由于与具齿原甲藻存在核酸序列一致性,该探针与具齿原甲藻有严重的交叉反应,但未发现与海洋原甲藻和其他藻的交叉反应.另外,研究还优化了破碎微型原甲藻细胞所需的超声时间以及获得探针的特异性所需的S1酶反应温度.本研究为实现对微型原甲藻海水样品的快速准确监测奠定了基础.     

生物胺对赤潮藻生长的影响作用初探

选取东海赤潮高发区常见的两种甲藻[东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)]和两种硅藻[中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、海链藻(Thalassiosirasp.)],以2-苯基乙胺、腐胺、亚精胺、精胺四种赤潮水体中常见的生物胺为因素,设置0、5、25、100nmol/L四个浓度水平,进行L16(45)正交添加培养实验。根据Logistic生长模型进行曲线拟合,分析得到的生长参数。结果显示,不同的生物胺对各赤潮藻生长影响的大小、趋势均存在差异。其中,2-苯基乙胺对四种赤潮藻的生长影响最显著。高浓度的2-苯基乙胺对中肋骨条藻的生长具有明显的抑制作用,对塔玛亚历山大藻的生长具有明显的促进作用。多胺物质(腐胺、亚精胺和精胺)对甲藻(东海原甲藻和塔玛亚历山大藻)生长的促进作用大于硅藻(海链藻和中肋骨条藻)。多胺中的亚精胺对塔玛亚历山大藻和海链藻的生长影响最大,精胺对东海原甲藻和中肋骨条藻的生长影响最大。多胺可能是2010年东海赤潮由中肋骨条藻向东海原甲藻演替的一个诱导因素,其中精胺可能发挥的作用较大。     

应用免疫荧光技术对三种赤潮藻的研究

为探索和建立免疫学结合荧光技术对赤潮生物的定性、定量检测,制备了3种粒径不同的赤潮藻——赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、共生甲藻(Symbiodinium sp)、链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)的多克隆抗体,并采用封闭吸附处理以提高抗体的特异性;采用间接酶联免疫法检测了抗体的效价;结果表明未经吸附处理的赤潮异弯藻、共生甲藻的效价分别为1:41 000,1:18 000以上,显示是高亲合力的抗体;链状亚历山大藻抗体的效价达到1:3 500,相比另两种藻的效价较低;吸附处理后的3种多克隆抗体的特异性明显提高,而效价有所下降。3种多克隆抗体与各自藻细胞均有很强的结合力,赤潮异弯藻和共生甲藻的荧光信号均匀分布于细胞表面,链状亚历山大藻细胞的荧光信号在细胞表面分布不均匀,主要集中在腹部横沟内。制备的多克隆抗体只与自身藻细胞结合,与另外2种藻细胞无交叉反应。链状亚历山大藻抗体只与自身藻细胞结合,与塔马亚历山大藻无交叉反应,可作为同属内不同种的鉴别。结合了免疫学和荧光技术,具有特异、灵敏、直观和简便的优点,并且费用低,对于开拓赤潮准确定性、定量检测方法和技术具有重要价值。     

海洋药源微藻研究进展

海洋微藻是海洋药物的一个重要来源,可从海洋微藻中筛选、分离和提取出多种具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和预防心血管疾病等功能的活性物质。本文概述了蓝藻门(Cyanophyta)、绿藻门(Chlorophyta)、硅藻门(Bacillariophyta)、金藻门(Chrysophyta)、红藻门(Rhodophyta)、甲藻门(Pyrrophyta)及其它门类海洋微藻的药用研究现状,介绍了各门类常见的药源微藻种类、主要活性物质和药理特性,概述了目前活性物质的应用情况,分析了海洋微藻开发过程中存在的问题和应用前景。通过本研究为进一步开发和利用海洋药源微藻提供参考。     

基于LAMP-LFD技术的有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)快检方法

以东海原甲藻的ITS序列(Internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将生物素标记的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增产物与经异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针特异性杂交,并结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)肉眼直接观察检测结果,建立了有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的快速检测技术。经优化后的最适条件为63°C、30min,较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明:LAMPLFD可特异性检出东海原甲藻,对常见赤潮藻检测结果均为阴性;其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL,是常规PCR技术(以F3/B3为引物)的10倍。LAMP-LFD技术能高效、特异地检出东海原甲藻,仪器设备依赖性低,结果可视化,有望成为赤潮原因种检测监控的常规方法。