鲫鱼(Carassius auratus)slc7A8基因分子特征及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆鲫鱼slc7A8基因的全长cDNA序列,对基因序列用生物软件对基因进行生物信息分析,用Real-time PCR方法检测基因在组织中的mRNA表达丰度。结果表明,鲫鱼slc7A8cDNA全长为2709bp,包含195bp的5′UCR序列,921bp的3′UCR序列,1593bp开放阅读框,编码530个氨基酸序列;鲫鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为88.9%和95.5%,而与其他动物分别在70.1%-74.8%和80.6%-82.1%之间;预测编码蛋白的分子量为57719.84,等电点为4.8,对其结构预测显示该蛋白具有与哺乳动物十分相似的12个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守,不同动物间的同源性都在92.2%以上;Real-time PCR检测鲫鱼组织中的mRNA表达丰度高低顺序为前肠、中肠、脑、后肠、肌肉、肾、鳃、心、肝脏。     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的FeSOD保守区域,设计简并引物,通过简并PCR的方法获得了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FeSOD(HpFeSOD)cDNA的部分序列,然后采用RACE方法分别克隆到5′端和3′端。拼接后得到HpFeSOD cDNA全长,该基因全长为1 138 bp,ORF为684 bp,编码227个氨基酸。把已经得到的HpFeSOD序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FeSOD氨基酸序列相比较,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻、衣藻、团藻、石莼、颤藻的同源性为89%、83%、78%、70%和63%。分子系统学分析表明,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻FeSOD聚在一起,介于真菌与高等植物之间并且真核微藻FeSOD与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及重组表达

采用EST结合RACE技术进行了曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型GST(SmGST)基因的克隆。结果表明,该基因的cDNA全长为838bp,其中5′非编码区为73bp,3′非编码区为150bp,开放阅读框为615bp,编码的蛋白含有204个氨基酸。该基因的氨基酸序列中包含1个典型的GST-N结构域和一个GST-C结构域,与栉孔扇贝和长牡蛎的sigma-型GST的相似度分别为40.3%和39.3%。将该基因的编码区重组到pET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达。重组SmGST的GST活力为(12.22±0.92)U/mg蛋白。     

可口革囊星虫(Phascoloma esculenta)铁结合蛋白基因的研究

根据已报道的铁结合蛋白基因的保守序列设计引物,用cDNA末端快速扩增(RACE)法,成功地从可口革囊星虫体液中获得铁结合蛋白基因的全长序列.结果表明,该基因cDNA全长1017bp,5'-端非编码区为15lbp,3'一非编码区为341bp,开放阅读框长度为525bp(括一个终止密码子),可编码175个氨基酸(GenBank:EU091352).该序列与加洲海兔、皱纹盘鲍、刺参、微小牛蜱、叉尾鲴、非洲爪蟾、小家鼠、人等的铁结合蛋白基因有67%-75%的同源性,而相应的氨基酸同源性为59%-76%.氨基酸相似性为74%*-89%%.分析结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中是高度保守的.     

小球藻△12脂肪酸去饱和酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的△12脂肪酸去饱和酶基因序列的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR的方法获得了小球藻NJ-7的内质网型△12脂肪酸去饱和酶基因(CvFAD2)的部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5'片段和3'片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA.该基因全长为2 032 bp,ORF为1158 bp,编码385个氨基酸,分子质量约为44 ku.根据已经得到的CvFAD2序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FAD2氨基酸序列相比较,同源性分别为普通小球藻(Chlorella vulgaris)75%,莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)57%,石榴(Punica granatum)57%,麻疯树(Jatropha curcas)52%.系统发育分析表明,南极小球藻CvFAD2基因与真核微藻(衣藻和普通小球藻)的FAD2基因聚在一起,介于真菌与高等植物之间,并且真核微藻FAD2基因与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近.     

大菱鲆生长激素基因cDNA的克隆、序列分析及分子系统研究

为了从分子水平研究大菱鲆生长激素作用机制及进化机制.以大菱鲆(Scophthalmus maximus)为材料从脑垂体中提取mRNA,利用SMART-RACE技术建立大菱鲆脑垂体cDNA文库,并从该文库中克隆出大菱鲆生长激素(growth Hormone,GH)cDNA全长序列.测序结果表明,克隆的大菱鲆GH cDNA序列全长为876 bp,包括108 bp的5'UTR和174 bp的3'UTR序列.该基因的开放阅读框全长591 bp,编码由197氨基酸残基组成的生长激素成熟肽序列,用生物软件DNASTAR计算大菱鲆生长激素蛋白分子量为1*!909.22,等电点为6.24.将大菱鲆与漠斑牙鲆、褐牙鲆等共7种鲆鲽鱼类GH成熟肽氨基酸序列进行比较分析,结果显示大菱鲆与其他6种鲆鲽鱼类序列同源性均为70%左右,而鲆科鱼类与鲽科鱼类间生长激素基因同源性很高(≥80%),说明大菱鲆与鲆科、鲽科鱼类的同源性较低.另外,运用PAUP软件对7种鲆蝶科鱼类与另外8种不同种属鱼类进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致,大菱鲆单独形成1个分支且与鲆科和鲽科鱼类相距较远,此结果为在形态学分类基础上进一步定义菱鲆属鱼类分类提供了理论依据.     

坛紫菜碳酸酐酶基因的克隆、表达及酶活性分析

以坛紫菜丝状体为材料,采用RACE方法获得坛紫菜碳酸酐酶(CA)基因的全长cDNA。该cDNA全长1 081 bp,具有一个825 bp的开放阅读框,可编码274个氨基酸。序列同源性分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与其他物种的碳酸酐酶具有较高的一致性,其中与条斑紫菜的一致性达到96%。氨基酸序列分析表明该蛋白为β-CA,含有两个CA活性位点,无跨膜结构,可能存在一个信号肽将其定位到叶绿体中,与藻类和细菌聚类。原核诱导表达得到一个72 kDa左右的融合蛋白,酶活测定结果显示此蛋白具有碳酸酐酶活性。该实验对进一步深入研究坛紫菜CA的功能及坛紫菜碳代谢、光合作用等生理过程具有重要的参考价值。     

碱蓬PEPCase基因的克隆与分析

采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次获得碱蓬(Suaeda glauca)中含PEPCase基因完整编码区的cDNA序列,长度为3 038 bp.获得的序列采用生物信息学方法和系统进化方法进行分析.结果表明,获得的cDNA序列包含2 898 bp的完整开放阅读框,编码的966个氨基酸序列含有两个PEPCase活性位点以及6种其他的活性位点;预测蛋白质的相对分子质量为109 785.3,等电点为5.51,属于不稳定的亲水性蛋白;含量相对较多的氨基酸是Leu、Glu、Arg、Asp、Ser,不含Pyl和Sec;不包含跨膜结构和信号肽序列,推断为非分泌性蛋白;二级结构以α螺旋为主,三级结构为紧密球状结构;分析结果还表明获得的碱蓬PEPCase基因应该属于C3型.通过对碱蓬PEPCase基因的克隆及序列分析从而为后期碱蓬PEPCase蛋白表达的研究及获得高油量的转基因碱蓬植株奠定了基础.     

克氏原螯虾热休克蛋白70ku类似物基因的cDNA分析

根据已测序的克隆号PCI246基因序列设计2条引物,用快速扩增cDNA末端技术扩增克氏原螯虾(Procambarus clarkii)70 ku热休克蛋白同类物基因cDNA的5'端片段和3'端片段,测序得到1 184 bp基因片段,包含该基因的完整3'端,GenBank登录号AY357302,与GenBank序列号AB016836家蚕(Bombyx mori)的70 ku热休克蛋白同类物mRNA的部分片段83%同源。和果蝇(Drosophila melanogaster)的热休克蛋白同类物3的同源性最高(GenBank的登录号分别是NP_727 563,NP_511 132,NP_727 564,NP_727 565),为85%。