长牡蛎电压门控钙离子通道β亚基的无标签亲和层析纯化

亲和层析是一种广泛使用的蛋白质分离纯化技术,常用的亲和标签包括谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、多组氨酸(polyhistidine)标签等.然而,外源亲和标签可能会影响蛋白质的结构与功能,通常需要酶切去除,造成实验流程加长、产率降低.某些蛋白质具有与亲和标签相似的氨基酸序列特征,利用这种...     

酵母双杂交系统的应用及发展前景

酵母双杂交系统有利于检测蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA和蛋白质与小分子之间的相互作用,因而对分子调控体系的研究起巨大的反 作用。文中系叙述了基于Ga14系统的双杂交技术的应用及其局限性,还介绍了单杂交系统、 双杂交系统、三杂交系统以及Sos恢复系统(SRS)。与其它领域一样,酵母双杂交系统将会在 海洋分子生物学研究中取得成功。     

蛋白质组学的研究概况及其在海洋生物学中的应用

随着DNA序列测定技术的飞速发展，人们可以在很短的时间内获得某种生物基因组的全序列。生物体的生命活动主要依赖于基因组的产物——蛋白质组，但是蛋白质组的研究相对于基因组来说却要复杂得多。蛋白质组技术是在细胞内整体蛋白质水平上进行研究，从蛋白质整体活动的角度来研究生命活动的规律。综述了蛋白质组和蛋白质组学出现的背景、起源、概念、研究技术、研究内容、面对的挑战、开展该项研究的意义、陆生动植物和微生物蛋白质组学的研究进展及海洋生物蛋白质组学的研究概况。目前，普通生物方面的蛋白质组工作开展得较多，海洋生物方面却相对滞后。种种迹象表明，开展海洋生物蛋白质组学研究，对揭示生命的奥秘、促进海洋资源的开发都有重大的推动作用。     

ChIP-seq技术的研究进展

染色体免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是研究DNA-蛋白质互作的有力工具,被广泛用于RNA聚合酶、转录因子和组蛋白修饰等在基因组上的精确定位。近年来,在ChIP-seq技术的基础上,科学家提出了一系列研究DNA-蛋白质互作的技术方法,提高了测序分辨率,降低了实验成本,极大推动了表观基因组学的发展。本文综述了多种DNA-蛋白质互作研究技术的原理及其应用场景,介绍了在单细胞水平上研究DNA-蛋白质互作的实现方法,并展望其未来发展的方向。     

蛋白质芯片在食品安全方面的应用

近年来,食品安全问题越来越引起人们的重视。由于蛋白质芯片能够在一次实验中对大量样本中的目的蛋白质同时进行检测,这一技术已引起人们的很大兴趣。蛋白质芯片在食品安全的检测方面有着很大的潜在价值,本文中作者就蛋白质芯片的基本原理、技术特点以及其在食品安全中的应用近况进行综述。     

病毒膜蛋白及其表达和纯化技术的研究进展

病毒囊膜是包膜病毒除核衣壳外的另一主要成分。它主要由多种蛋白质构成，称为膜蛋白，膜蛋白以单聚体，二聚体，三聚体，甚至更多的聚合体的形式存在，具有中和抗体，与靶细胞受体结合，凝集红细胞，诱导细胞融合等多种功能，膜蛋白可采用将其基因整合入载体，并在昆虫细胞，哺乳细胞或细菌中获得体外表达，膜蛋白可在去污剂的作用下形成蛋白质－脂－去污剂的复合物而被溶解，其中去污剂的临界微团浓度，亲水物－亲脂物平衡值，荷电、紫外穿透性等是选择合适去污剂的主要参考因子，溶解后的膜蛋白多利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析等技术并结合梯度离心；分级沉淀等进行分离、纯化。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ＾－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

双向电泳的技术原理及在水产动物病害研究上的应用展望

双向电泳技术作为高效、高分辨率的蛋白质分析手段，在现代生命科学研究中扮演着重要的角色。本文概述了双向电泳技术的应用现状、存在问题及未来发展方向，并对其在水产动物病害研究中的应用进行了简要介绍。     

磷沙蚕凝集素的分离纯化及生物活性研究

采用DEAE-Toyopearl阴离子交换树脂、Bio-Gel P-100分子筛层析、Lactosyl-Sepharose4B亲和层析和Sephadex 75分子筛层析技术从日本海的海洋无脊椎动物磷沙蚕(Chaetopterus variopedatus)中分离出2种凝集素,通过体外细胞活性和酶活性实验观察它们的生物活性。结果表明,从海洋无脊椎动物磷沙蚕中分离出一种β-半乳糖特异性凝集素(CVL)和一种具有血凝活性,但不被经测试的单糖和糖蛋白所抑制的相对分子质量为30 000的蛋白质(CVL-1)。β-半乳糖特异性凝集素(CVL)具有体外抑制NB4白血病细胞株的活性和抑制小鼠脾细胞的活性,IC50分别为7.87 mg/L和22 mg/L。同时,另一种蛋白质(CVL-1)具有β-葡萄糖苷酶活性。     

团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定

采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

Studies on isoenzymes of glutathione S-transferase in the digestive gland of Mytilus galloprovincialis with exposure to pollution

The possible utility of glutathione S-transferase isoenzymes in affinity purified extracts of digestive gland from Mytilus galloprovincialis as indicators of exposure to organic pollution has been assessed by fast protein liquid chromatography (FPLC) using a Mono-Q ion exchange column. Four main peaks of protein (isoenzymes 1–4) were detected in these chromatographic studies all of which displayed detectable catalytic activity with 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and glutathione as substrates. The bulk of the activity with these substrates was associated with isoenzyme 1. The specific activity of cytosolic extracts from six sites in Venice Lagoon and the Adriatic Sea (UNESCO-MURST Venice Lagoon Ecosystem Project) decreased slightly with increasing tissue levels of chemical contaminants (hydrocarbons, PCBs and organochlorines). FPLC of affinity purified extracts from three of these sites was used to assess the possible variation in the levels of individual isoenzymes relative to pollution status. No difference was observed in the levels of these isoenzymes.     

一种来自海洋细菌的血纤维蛋白溶酶的分离纯化及性质研究

利用硫酸铵分级盐析、DEAE－纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析法对由海洋细菌FE92－8分泌的纤维蛋白溶酶进行了分离纯化，结果得到SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳单一区带。性质研究发现，该酶分子量为12.6kD，等电点为7.45，琼脂糖－纤维蛋白平板法测得该酶作用的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在37℃，pH为8.0的情况下表现出很好的稳定性，温度起来50℃热稳定性较差，在碱性环境中稳定性较在酸性环境中稳定性强，阴性平板和阳性平板对比实验发现，该酶只有纤溶活性而无激酶活性，体外实验发现，该酶具有快速溶解血栓的能力。     

近海温泉中嗜热菌Geobacillus sp. ZH1锰超氧化物歧化酶的克隆与表达

将嗜热菌Geobacillus sp. ZH1的超氧化物歧化酶(supseroxide dismutase,SOD)基因插入表达载体pET-32α(+),在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,并利用亲和层析纯化重组超氧化物歧化酶.将制备的脱辅SOD进行Mn2+和Fe2+金属重构后,得到的Mn2+重构SOD的比活力达668U/mg,Fe2+重构Fe-SOD没有活性,说明ZH1菌株的超氧化物歧化酶为Mn-SOD.凝胶过滤及SDS-PAGE分析显示,Mn2+重构SOD为同聚二聚体,亚基分子量为71.7 kDa.这些研究结果为进一步研究该酶的生化特性及酶的定向进化研究奠定了良好的基础.     

一种新的海洋微藻病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其活性分析

从海洋球石藻Emiliania huxleyi病毒EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶(Sp)基因(GenBank登录号:KC161207),对该基因的开放阅读框(ORF)进行系统的生物信息学分析,并在大肠杆菌中融合表达,通过亲和层析法获得了纯化的重组Sp。结果表明:EhV99B1-Sp基因的ORF为1 110bp,编码368个氨基酸,蛋白相对分子质量为39.5kDa;该基因片段与GenBank中EhV86-Sp的同源性很高,核苷酸及其对应的氨基酸序列同源性分别为95%和97%,而与其他物种Sp序列的同源性仅为28%~32%,说明其可能是丝氨酸蛋白酶家族中的一个新成员;预测的二级结构特征显示EhV99B1-Sp的蛋白结构域中具有典型的LTAGHC(组氨酸活性位点区域)和AICNGDSGGPLF(丝氨酸活性位点区域)两个丝氨酸蛋白酶催化活性位点的氨基酸基序,是一个两次跨膜蛋白;将该基因在大肠杆菌中进行低温诱导表达,得到分子量为60kDa的重组蛋白,经鲤鱼肌肉丝氨酸蛋白酶(MBSP)抗体检测证实为Sp,且重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有明显的生物学活性。本研究结果为进一步探讨EhV99B1-Sp在病毒与宿主相互作用过程中的调节作用及其功能与应用奠定基础。     

鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶MltD的表达纯化及生物信息学分析

本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符。生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白。鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性。推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制。     

大黄鱼β2-微球蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的重组表达

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一类高度多态的基因群，它广泛分布于各种脊椎动物体内，在启动特异性免疫应答中起关键作用．MHC根据结构分为Ⅰ型和Ⅱ型两种．β2-微球蛋白（β2mcroglobulin，β2m）是MHCI型分子的轻链．本文根据大黄鱼β2m的表达序列标签（expressed sequence tags，EST）序列设计合成了特异性引物，利用RT—PCR技术从大黄鱼脾脏组织中克隆了β2m基因（Pscr-β2m）；构建了合β2m因的原核表达载体（pGEX4T-2-β2m，在0．1mmol／dm^3IPTG诱导下重组β2m得到了表达；采用Sepharose 4B亲合层析纯化目的蛋白并制备了抗体；Western—blotting分析证实了该抗体具有与天然大黄鱼脾脏组织中β2m蛋白反应的特性．这些结果为进一步研究鱼类β2m构与功能的关系，以及制备MHCI类分子四聚体奠定基础．     

玻尿酸合成酶的鲨鱼源单域抗体筛选

在鲨鱼等软骨鱼类体内存在天然的缺失轻链、仅包含重链的抗体,源于这种重链抗体可变区的片段称为单域抗体(single domain antibody)。目前单域抗体研究中的抗原主要来源于水溶性蛋白或病原体,筛选膜蛋白鲨鱼源单域抗体的领域接近空白。本研究以重组表达的小球藻病毒玻尿酸合成酶(一种膜蛋白)为抗原,经过免疫、建库、淘选、验证等步骤获得了抗原特异性条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)单域抗体序列。随后利用大肠杆菌表达了该单域抗体,通过等温滴定量热技术(ITC)测定了其与抗原的亲和力,证实了以膜蛋白作为抗原制备鲨鱼源单域抗体的可行性。