大型藻酶解单细胞用于贝类育苗的研究

用海藻工具酶将紫菜和裙带菜解离成单细胞作为饵料对海湾扇贝亲贝和幼体、魁蚶亲贝和皱纹盘鲍稚鲍进行了研究。结果表明：(1)海湾扇贝亲贝全喂紫菜细胞其效果与喂全微藻的效果相近，亲贝都能成熟，排放精卵和正常胚胎发育。微藻与紫菜细胞混合投喂可加速性腺发育，性腺指数较高。全喂紫菜细胞能够满足幼体的生长发育和变态。但变态率、生长率较全喂微藻和混合投喂的低。(2)紫菜细胞和微藻分别或混合投喂魁蚶亲贝，都能满足亲贝的性腺发育，进行正常受精、孵化和变为D形幼体。(3)用裙带菜细胞投喂稚鲍与人工配合饵料比较，能显著提高稚鲍的存活率。研究表明。由大型藻生产单细胞饵料，在海产动物育苗中具有广阔的应用前景。     

植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用

利用酶解技术制备高活力的条斑紫菜原生质体；通过优化原生质体的制备工艺和培养条件，建立了条斑紫菜原生质体的无菌培养体系，同时首次证明了高等植物组织培养中常用的两种激素NAA和6－BA对紫菜细胞生长具有明显地促进作用，并应用这两种激素建立了条斑紫菜原生质体的固体培养方法，为开展紫菜遗传转化中阳性克隆的定向筛选，以及探讨紫菜的基础生理生化反应机制奠定了良好基础。     

现代生物技术在紫菜属中的应用

本文综述了近十年来国内外紫菜生物技术的发展与研究。在细胞生物学方面，介绍了紫菜原生质体制备、组织培养和细胞融合等技术，及其在新种质创建，工业苗种生产、单细胞活饵料开发和基因组操作等研究中的广泛应用，而细胞分光光度技术（MSP）和流式细胞技术（FCM）的加盟使得对紫菜细胞DNA的了解达到量化，快速分选细胞并实现对其生理代谢动态 观测，在生物化学方法中，讨论了用同工酶电泳技术来评价紫菜群体遗传结构、鉴别种质和描述系统发育等研究，以及利用生化方法对糖类等其它化合物进行提纯与测定等工作，在分子生物学方面；总结了如何获得高纯度DNA，并将其应用于DNA分析研究，RFLP、RAPD和DNA-序列测定等分子标记技术所揭示的紫菜的多态性，以及利用DNA-指纹和消减DNA文库的技术来构建紫菜的质体基因图谱和cDNA文库，并进行紫菜比较基因组学的研究，此外还介绍了紫菜基因转移方面的工作。     

紫菜色素突变体诱导的研究——II. NG 对紫菜叶状体诱变的效果及遗传分析

用强诱变剂 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NG）处理条斑紫菜和坛紫菜的幼嫩叶状体，进行色素突变体诱导。结果表明：(1) 在相同实验条件下，两种紫菜的对照材料都未发现突变现象，而各诱变组都容易观察到突变的细胞或细胞块，表明在实验中发生的突变是诱变的结果。(2) 突变率随诱变剂量和诱变时间的增加而上升。在实验范围内，随着诱变强度的增加，条斑紫菜的突变率 从 最 低 的 11.2 % 上升到 28.7 %。坛紫菜从 10.1 % 上升到 20.2 %。（3）在同等面积的叶片上，诱变产生的突变型细胞数量，并不随诱变强度的增加而增加。实验使用定量视野检试，两种紫菜在各诱变组中出现的突变细胞数量基本相似，略高的突变值都发生在诱变实验的最低剂量组中。突变率表示突变细胞在存活细胞中所占的比例，而单位面积中的突变细胞数量，反映了诱变的效果。根据这一分析，可以认为 NG 浓度 25 μg/mL、诱变时间为 30 min 是合适的诱变条件。     

坛紫菜单性叶状体细胞的发育研究

研究采用雌雄营养组织块和营养细胞进行培养,以了解坛紫菜单性营养细胞的生长发育情况.结果表明,坛紫菜雌性营养细胞无论在组织水平还是在细胞水平均以产生红色果胞或果孢子细胞为主,有少量细胞发育成精子囊,并放散精子.雄性营养组织和营养细胞以产生精子为主,但不能再分化成丝状体;产生的少量果孢子细胞能发育成丝状体.因此,在室内培养条件下,坛紫菜单性叶状体都能产生两性细胞,它们的差异只是不同性细胞所占的优势不同,并讨论了单性叶状体的产生.     

紫菜色素突变体诱导的研究—Ⅱ.NG对紫菜叶状体诱变的效果及遗传分析

用强诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NG)处理条斑紫菜和坛紫菜的幼嫩叶状体，进行色素突变体诱导。结果表明：(1）在相同实验条件下，两种紫菜的对照材料都未发现突变现象，而各诱变组都容易观察到突变的细胞或细胞块，表明在实验中发生的突变是诱变的结果。(2)突变率随诱变剂量和诱变时间的增加而上升。在实验范围内，随着诱变强度的增加，条斑紫菜的突变率从最低的11．2％上升到28．7％。坛紫菜从10．1％上升到20．2％。(3)在同等面积的叶片上，诱变产生的突变型细胞数量，并不随诱变强度的增加而增加。实验使用定量视野检试，两种紫菜在各诱变组中出现的突变细胞数量基本相似，略高的突变值都发生在诱变实验的最低剂量组中。突变率表示突变细胞在存活细胞中所占的比例，而单位面积中的突变细胞数量，反映了诱变的效果。根据这一分析，可以认为NG浓度25μg/mL、诱变时间为30min是合适的诱变条件。     

琼胶寡糖聚合度对坛紫菜抗性诱导的影响

研究了琼胶寡糖聚合度对坛紫菜抗性诱导的效应。以琼胶3,6和12糖,3种聚合度的琼胶寡糖为材料,处理坛紫菜,通过观察叶片腐烂率比较坛紫菜生长状态;利用透射电镜观察处理后的细胞亚显微结构变化;并检测坛紫菜附生菌的数量变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜H₂O₂释放量;利用实时定量PCR检测坛紫菜NADPH氧化酶基因(Phrboh)的差异表达。结果表明,经琼胶3糖和6糖处理,坛紫菜的Phboh表达出现上调,并产生H₂O₂暴发。经两种琼胶寡糖处理后,坛紫菜的附生菌数量明显减少,其中以琼胶6糖的效果最好,在较长培养时间内,坛紫菜能保护自身细胞亚显微结构的完整性,维持良好的生长状态。而琼胶12糖没发现任何诱导作用。综上所述,聚合度为3和6的琼胶寡糖能诱导坛紫菜的抗性响应,特别是形成单个螺旋结构的琼胶6糖的诱导作用最明显,但聚合度较大的琼胶寡糖则不能。     

条斑紫菜Porphyra yezoensis Ueda营养细胞的分离和培养

条斑紫菜营养细胞在一定条件下(主要是温度)可转化成单孢子,经放散、附着,再发育成新的藻体。但单个营养细胞在未形成单孢子以前,能否发育成新藻体尚未见报导。已知海带(Laminaria japonica)、凋毛藻(Griffithsia pacifica)、尾丝藻(Uronema gigae)、石莼(Ulvapertusa Kjellm),浒苔(Enteromrpha intesinalis(L.)Grer.)和若干种高等植物的营养细胞能在适当的条件下发育成新的植物体。条斑紫菜的营养细胞有无这样的发育全能性,对此,我们从1979年3月开始,反复进行了四次实验。结果表明,这种紫菜营养细胞的发育全能性是存在的。     

坛紫菜营养细胞和原生质体培养研究——Ⅱ.直接育苗下海养殖的实验研究

本文报道了王素娟等用坛紫菜(Porphyra haitanensis)营养细胞在苗绳上代替壳抱子采苗,并将幼苗下海养殖的实验。实验中,作者先酶解种藻成单离细胞,使附着于网绳上,在室内培养成O.2—0.5mm的幼苗,然后下海养殖,1个月后,幼苗长成了20—40cm的紫菜,藻体最长者可达58cm。结果表明:冷藏一年的2—5cm的幼苗解离细胞可以长成正常的商品紫菜。坛紫菜营养细胞可用作新苗源,它可以改革传统的生产程序,这在紫菜生产领域内具有重要意义。     

激光显微切割条斑紫菜叶状体的参数优化

本研究以经济红藻条斑紫菜(Pyropia yezoensis)为研究对象,应用激光显微切割技术(Laser Microdissection,LMD)分离不同时期、不同部位、不同组织紫菜叶状体细胞团。统计细胞团中成活细胞比例,测定成活率,并应用叶绿素荧光成像法测定成活细胞光合活性,建立适合不同类型细胞的激光显微切割流程。结果表明:(1)整个切割流程需要在30 min内完成,不同材料成活率由高到低为:精子囊、成熟紫菜顶部、紫菜幼苗基部、成熟紫菜基部、幼苗顶基部,同株紫菜相同区域的中央与边缘细胞切割后成活率相近;(2)显微切割获得的紫菜细胞团的各项叶绿素荧光参数中,最大光量子传递效率F_v/F_m、实际光量子传递效率Y(Ⅱ)、光化学淬灭qP下降、非光化学淬灭qN上升,其中F_v/F_m、Y(Ⅱ)变动均高于其他参数,可作为指示切割细胞团光合能力的敏感指标;(3)不同时期紫菜适用的切割技术不同:成熟条斑紫菜在10、20、63倍镜下切割的直径100～300μm细胞团,幼苗在6.3、10、20倍镜下切割的直径150～300μm细胞团,成活率高且具有较高的光合活性。本研究针对条斑紫菜不同材料摸索形成适宜的切割技术参数,最少可从100μm直径细胞团(约20细胞)中获取1～6个成活细胞,为细胞的精确分离提供了新的技术手段。     

五种紫菜同工酶标记的遗传分析

用垂直凝胶电泳来研究采自中国的（条斑紫菜×坛紫菜）杂交种、坛紫菜、条斑紫菜、少精紫菜、半叶紫菜的同工酶多态性。然后分析最小可能位点数和观察同位基因数、遗传差异性和采用平均连接聚类法。选取23种酶带中的六个酶（MDH，ME，LDH，GDH，IDH和G-6-PDH）进行分析。最小可能等位基因位点数显示五种紫菜在ME等位基因位点都只有一个。LDH和GDH等位基因位点半叶紫菜和少精紫菜和另外的三种紫菜不同，而在分析MDH时半叶紫菜比较独特。在IDH位点分析时少精紫菜和坛紫菜和其他三种不同，而条斑紫菜和坛紫菜和其他三种不同在G-6-PDH位点不一致。总的来看，最小可能等位基因位点数分析半叶紫菜是最分离的。遗传多样性结果分析表明当遗传相似度为0．7550时，五种紫菜中的遗传变异研究受到限制。条斑紫菜和坛紫菜的杂交种非常接近少精紫菜。当遗传相似度达到0．8937时，出乎意料的是条斑紫菜和坛紫菜遗传同一。性很低。条斑紫菜4个株系的平均遗传相似度仅为0．7428，差异比较大。在所有紫菜中半叶紫菜是最分化的分支，它与最小可能等位基因位点数分析一致。     

紫菜的细胞遗传学研究现状及展望

综述了紫菜属的染色体数目、形态、ＤＮＡ 含量和减数分裂的发生等细胞遗传学研究的概况。７０ 多种紫菜已有５４ 种做了染色体计数,紫菜属染色体的一个显著特征是染色体小。据调查,种内染色体数目不同,尚属计数误差。作者并对紫菜的单性生殖和减数分裂提出了可能解决的途径     

坛紫菜叶状体形成放散单孢子的初步研究

坛紫菜(Porphyra haitanensis)盛产于我国福建、浙江两省,是闽、浙沿海栽培的主要种。生产上通常是利用坛紫菜丝状体放散的壳孢子作为苗源。到目前为止,人们一般认为坛紫菜是不放散单孢子的。 近几年来科学工作者试验采用酶分解法把坛紫菜叶状体分解为营养细胞和原生质     

紫菜丝状体DNA的提取

紫菜(Porphyra spp.)是一种大型红藻,它的孢子体世代是丝状体.丝状体适于在常温条件下(20℃左右)长期保存和培养,是筛选丝状体优良栽培品系,利用光生物反应器进行紫菜育苗的理想材料.紫菜细胞含有大量胞外多糖,主要以硫酸基多糖和羧基多糖形式存在,它们比陆生植物的中性多糖更易溶于水,与DNA产生共沉淀,从而影响限制性内切酶的消化和PCR扩增.另外,紫菜细胞DNA含量较少,DNA酶含量却很高,使紫菜DNA提取的得率不足[1].     

紫菜育种的困难与对策分析

紫菜是紫菜属（Porphyra）大型红藻总称。紫菜广泛分布于寒带到亚热带的潮间带。中国北到辽宁南至海南都有分布。中国栽培紫菜主要是坛紫菜（南方）和条斑紫菜（北方），只在浙江两种紫菜都有栽培。目前，中国紫菜育苗亲本基本上采自野生群体或未经遗传改良的栽培群体，遗传纯合紫菜品种（系）培育和栽培多处在实验研究阶段。在面临病害频发及产量、质量下降等问题的情况下，为保障中国紫菜栽培业持续健康发展，系统的紫菜育种迫在眉睫。但是，紫菜栽培只有几十年的历史，其育种还处在初级阶段，另外，紫菜的生物学特性不利于育种。作者对紫菜育种的困难进行了分析并探讨了紫菜育种的方法学对策。     

60Co－γ辐照对坛紫菜原生质体诱变的研究

利用^60Co-γ射线对坛紫菜（Porphyra haitanensis）原生质体进行辐照诱变，发现原生质体对^60Co-γ射线有极强的耐受性。前期的培养结果表明，原生质体是一种理想的诱变材料。诱变结果表明，^60Co-γ射线对坛紫菜可诱变剂量范围很大，从200-1300 Gy均有突变株生成。诱变后细胞的存活率不宜作为坛紫菜诱变最佳剂量的指标。     

紫菜腐霉侵染对条斑紫菜叶状体防御性物质含量及保护性酶类活性的影响

研究了紫菜腐霉侵染对条斑紫菜叶状体防御性物质脯氨酸(Pro),保护性酶类苯丙氨酸转氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO),防御信号活性氧(ROS)和细胞损伤指示性物质丙二醛(MDA),在不同时间点(0、1、3、5、7、9d)的含量和活性影响。实验结果表明:紫菜腐霉侵染能够打破细胞ROS的动态平衡,引起ROS含量极显著增加(P0.01),进而影响细胞渗透压平衡,表现为Pro含量极显著增加(P0.01),并导致细胞内保护酶类PAL和PPO活性极显著增加(P0.01),并且ROS积累引起细胞膜脂过氧化,MDA含量发生极显著变化(P0.01)。由此推测条斑紫菜叶状体对紫菜腐霉侵染的生理响应过程为:紫菜腐霉侵染引起藻体ROS含量积累上升,积累的ROS激活机体防御系统,Pro含量增加以调节细胞渗透平衡;同时积累的ROS激活细胞内保护酶类,PAL和PPO的活性增强。迅速积累的ROS引起细胞损伤,导致细胞膜脂过氧化,产生并积累MDA。本实验为全面了解条斑紫菜防御紫菜腐霉侵染的机制奠定了基础,同时为后续条斑紫菜赤腐病抗性品系的选育提供了理论指导。     

条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的提取

提取条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的新方法。先用海螺酶处理紫菜叶状体制备细胞,然后用SDS-蛋白酶K裂解细胞提取总DNA,再用玻璃粉浆(glassmilk)对其纯化,经纯化后的总DNA能被EcoRI,Dral与HaeⅢ等限制酶完全酶切,并在酶切图谱上形成明显的DNA带型。当用异硫氰酸胍一十二烷基肌氨酸钠裂解紫菜细胞时,在总DNA提取物中直接发现有一条质粒状DNA带(2.3Kb),即建立了一种极简便的质粒状DNA提取方法。     

不同培养条件对坛紫菜叶状体体细胞发育分化影响的研究

本文以野生坛紫菜(Porphyra hatanensis)叶状体为材料,通过海螺酶酶解获得叶状体单离体细胞,探讨了细胞密度、光照强度对坛紫菜叶状体体细胞发育分化的影响.研究结果表明:细胞密度对坛紫菜叶状体单离体细胞的分裂、出苗具有明显的影响.其中,细胞培养3～5d时,分裂率随着细胞密度的增大而降低;5d时,1×103个/孔组的分裂速度显著大于其余各组的(p＜0.05);12～19d时,随着细胞密度的增大,体细胞出苗率相应减小.光照强度对坛紫菜叶状体单离体细胞的分裂、出苗也具有显著影响.细胞培养5d时,分裂率随着光照强度的增大而增大;5-7d时,体细胞分裂速度随着光照强度增大而增大;9～19d培养期内,出苗率随着光照强度的增大而增大.本实验结果为坛紫菜转基因育种等研究提供了可资借鉴的基础资料.     

紫菜营养细胞的酶法分离和在水产养殖中的应用

紫菜是国内外养殖最多的重要经济海藻之一。它的养殖包括果孢子采苗、丝状体培养、壳孢子采苗和海上养殖等过程。利用上述采苗方法,在室内培育丝状体的时间长达半年之久,技术操作复杂,需要进行温度、光照的控制和施肥管理等,也容易发生病害。 近年来,用酶学方法分离紫菜细胞,进行细胞和原生质体的培养,并且都获得了再生植株。为了使生物技术应用于紫菜栽培业,我们