冈村枝管藻叶绿体psbA基因的克隆及序列分析

psbA基因编码光合系统Ⅱ反应中心的D1蛋白,是叶绿体基因组中一个重要的光调控基因.根据网管藻(Dictyosiphon foeniculaceus)、髋藻(Myelophycus simplex)、粗粒藻(Asperococcus fistulosus)、索藻(Chordaria flagelliformis)、点叶藻(Punctaria latifolia)、水云(Ectocarpus siliculosus)、铁钉菜(Ishige okamurae)、绳藻(Colpomenia sinuosa)、网胰藻(Hydroclathrus clathratus)、幅叶藻(Petalonia fascia)等10种藻类的psbA基因高度保守序列,设计引物,利用PCR方法从冈村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)基因组DNA中扩增出约750 bp的片段,将该片段连接到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明:片段长度为737bp,推导的245个氨基酸序列与网管藻、髋藻、粗粒藻、索藻、点叶藻、水云、铁钉菜、绳藻、网胰藻、幅叶藻的D1蛋白相对应的氨基酸序列的同源性均高于96%.该基因序列已被GenBank收录,登录号为EU332142.     

细胞结构对浮游植物光学特性的影响

藻细胞抽象为细胞质和叶绿体构成的两层球体结构, 结合Aden-Kerker散射理论, 分析了藻细胞各物理属性对其光学特性的影响, 同时也与均匀球体藻细胞的光学特性进行了对比分析。分析结果表明, 与均匀球体结构相比, 叶绿体为外裹层的细胞结构将显著增强其后向散射效率及后向散射比率, 而叶绿体为内核层的细胞结构因打包效应将削弱藻细胞的吸收效率; 当叶绿体为外裹层时, 细胞粒径大小、叶绿体相对体积、叶绿体复折射率的虚部都对藻细胞的吸收效率会产生显著影响; 同时, 细胞粒径大小和叶绿体复折射率实部是决定细胞后向散射效率和后向散射比率的两个重要指标。     

盐藻的室温光抑制

实验用盐藻取自天津塘沽轻工业部制盐研究所,采用ＡＳＰ２培养液为培养基,研究了盐藻的室温光抑制现象,并探讨了盐藻的光保护反应机理,结果表明,盐藻对高辐照有很强的忍耐力,且光合能力的恢复也很强,氯霉素（ＣＡＰ）或二硫苏糖醇（ＤＴＴ）在高光下强烈地加深了对ＰＳＩＩ光化学效率（Ｆｖ／Ｆｍ）和光合量子效率（Φｉ）的抑制,但ＣＡＰ或ＤＴＴ单独作用并不抑制盐藻的光化学系统在低光下的可逆恢复;盐藻在ＣＡＰ＋ＤＴＴ     

华北半叶紫菜藻胆体的光谱特性和光能传递的研究

红藻的光合器是由叶绿体和藻胆体组成的。藻胆体由多种藻胆蛋白和在结构上起连接作用的无色蛋白或多肽所组成。藻胆体与类囊体片层紧密结合,在单位类囊体的片层上藻胆体的数目因生物种类不同及其所处环境条件的不同而异;一般为400—1200个/μm~(-2)。 藻胆体的功能是捕获光能和将光能传递给类囊体片层上叶绿素a,以进行光合作用。 红藻藻胆体中藻胆蛋白之间光能传递顺序为:R-藻红蛋白→R-藻蓝蛋白→别藻蓝     

单细胞绿藻的77K荧光特异性研究

实验测定了10种单细胞绿藻包括5种淡水藻:雪衣藻(Chlamydomonas nivalis UTEX2765)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea CH)、绿球藻(Chloroccum tatrense UTEX2227)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、雨生红球藻(Haematococcus sp.CSIRO:CS-321)和5种海水藻:杜氏盐藻(Dunaliella salina)、四爿藻(Tetraselmis sp.)、蒜头藻(Monodus subterraneus)、小新月藻(Closterium venus)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)的77k荧光光谱,并与大型海洋绿藻以及高等植物菠菜进行了比较。结果表明,10种单细胞绿藻都缺少作为高等植物PSⅠ主要表征的730nm长波荧光峰。按荧光主峰的波长,可以分为2种类型:雪衣藻、绿球藻、杜氏盐藻、四爿藻、蒜头藻、小新月藻、亚心形扁藻的荧光主峰位于684nm,椭圆小球藻、斜生栅藻、雨生红球藻的荧光主峰位于714nm。这个结果与海洋管藻目绿藻和某些大型海洋绿藻的荧光特性一致。另外,绿藻PSⅠ缺少730nm长波荧光峰具有普遍性,预示这些藻类在PSⅠ结构以及能量传递等方面与高等植物有很大的差异。     

盐藻的一种盐诱导碳酸酐酶基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用5′RACE和巢式PCR的方法确定盐藻(Dunaliella salina)一种盐诱导碳酸酐酶基因的转录起始位点,通过序列分析得出转录起始位点为A,从而确定核心启动子及上游调控区的位置。应用巢式PCR技术分别扩增盐藻这种碳酸酐酶基因上游调控区的2个片段,长度大约分别为0．8和1．2kb,序列经测定无误后分别与带β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因的载体相连接,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。用基因枪法将这两个载体导入盐藻细胞中,经染色检测,GUS基因在转化藻株中得到瞬时表达。     

盐藻过氧化物酶的盐适应性及其与物质积累的关系

实验分析了不同浓度NaCl处理下,培养盐藻的过氧化物酶(POD)活性及其与细胞密度、β-胡萝卜素积累和蛋白质积累的关系.结果表明,盐藻过氧化物酶活性随盐度变化而改变:在适当盐度(60～90g/L)下,过氧化物酶活性很低;在较低盐度(30～60g/L)或较高盐度(90～150g/L)下,盐藻过氧化物酶活性均显著升高,说明盐藻过氧化物酶是一种盐度逆境适应酶.盐藻过氧化物酶活性与盐藻细胞密度及物质积累关系密切:盐藻过氧化物酶活性很低时,盐藻细胞密度大,同时β-胡萝卜素和蛋白质积累也多;随着盐藻过氧化物酶活性升高,盐藻细胞密度、β-胡萝卜素和蛋白质积累均逐渐降低,但盐藻过氧化物酶活性进一步升高时,盐藻蛋白质积累又有增加,可能在盐藻体内有逆境蛋白产生.     

干燥胁迫对几种单胞藻的影响

研究了三种单胞藻（新月菱形藻、盐藻和小球藻）肿离海水后在室内晾干不同时间对其生长的影响,结果表明,晾干３ｈ,对盐藻和小球藻影响不大,晾干６￣９ｈ,失水超过５０％复水后,盐藻就停止生长,小球藻就逐渐死亡。新月菱形藻和两种绿藻有很大不同,晾干３ｈ对其生长有促进作用,晾干６￣９ｈ对其生长有轻微抵制作用;室内自然光下晾干经暗中晾干有较大的损害。三种藻以干燥胁迫的耐受力不同,新月菱形藻最大,其次是盐藻,小球     

红藻真江篱质粒的发现

于1992年4月一1993年4月，用液氮研磨-苯酚／氯仿抽提-异丙醇沉淀的方法提取青岛沿海产紫菜、真江蓠、龙须菜、海膜4种红藻的总DNA；利用Hoechst－CsCl密度梯度起离心法将叶绿体DNA与核DNA分开。对抽取的叶绿体DNA梯度组分电泳结果表明，真江蓠样品出现质粒的电泳条带。以透射电镜观察到闭会环状DNA图像（周长平均值为4.3×10－7m，约为1．3kb）；分子杂交结果显示，真江蓠质位与其叶绿体DNA之间没有同源性，而与核DNA之间有一定同源性。     

中国明对虾血蓝蛋白C末端片段在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为研究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白C末端(FcHC-C)的抗菌功能,将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经SalI酶切后,采用PEG法转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。转化子经过PCR鉴定后,阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选,获得高拷贝重组子。重组毕赤酵母利用甲醇诱导表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段(rFcHC-C1和rFcHC-C2)。抑菌活性鉴定实验结果显示,重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。     

用显微注射方法分析牙鲆肌肉发育调节基因MyoD, Myf5的启动子序列

克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉发育调节基因MyoD和Myf5的启动子序列,分别为608 bp和1 073 bp。对序列进行分析发现MyoD和Myf5的启动子含有参与肌肉发育调控的基因的结合位点。将MyoD和Myf5的启动子连接到GFP载体上,构建了重组质粒MyoDP-GFP和Myf5P-GFP,并注射到一细胞或两细胞的斑马鱼胚胎中,对这两个基因的启动子进行了瞬时表达研究。结果表明,牙鲆MyoD和Myf5的启动子可以驱动绿色荧光蛋白特异地在斑马鱼肌肉纤维中表达,因此牙鲆608 bpMyoD和1073 bpMyf5的启动子包含着可以驱动MyoD和Myf5正常表达的必需元件,它们是肌肉特异的,并且可以跨物种行使其功能。     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.     

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。     

除草剂草丁膦抗性基因bar作为三角褐指藻基因工程选择标记的研究

研究了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)对氯霉素、卡那霉素、青霉素、链霉素、潮霉素5种抗生素和一种除草剂草丁膦的敏感性,发现三角褐指藻对草丁膦非常敏感,用统计学分析法得出了其72h半致死质量浓度为22mg/L。通过基因枪法将携带草丁膦抗性基因bar的载体pSVB导入三角褐指藻细胞中,通过草丁膦筛选成功获得了抗性藻细胞,PCR检测获得阳性结果,提示草丁膦更适合用于构建安全、高效、廉价的三角褐指藻表达系统。     

Genomic cloning and expression of vitellogenin gene from the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus (Cyprinodontiformes, Rivulidae)

We cloned the vitellogenin gene from the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus, and sequenced 12,326 bp. The number of exons of R. marmoratus and rainbow trout vitellogenin genes were different, and also the splicing junctions are different throughout most of the exons and introns but the amino acid similarity of R. marmoratus vitellogenin gene to other species was rather high. In promoter region of R. marmoratus vitellogenin gene, there were several E2 binding sites and the estrogen response element (ERE). We discuss here the gene structure and expression of R. marmoratus vitellogenin gene.     

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表达载体的构建与电转化

海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素对海洋球石藻生长的影响,确定G418可作为该藻阳性转化藻株的抗性筛选试剂,其对应的抗性基因neo则作为该藻表达载体构建中的抗性筛选标记。在此基础上克隆了绿色荧光蛋白基因gfp、抗性标记基因neo及E. huxleyi BOF92内源性岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子fcp,以pUC18为基础载体,构建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo两个重组表达载体,以电转化方法共转化球石藻细胞并结合选择性固体培养基筛选,成功获得了被转化的球石藻细胞。海洋球石藻遗传转化系统的建立为进一步开展该种相关的基础生物学研究及其在生物技术领域的应用奠定了基础。     

刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体c DNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Ci GAPDH),定点诱变Ci GAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后,构建其原核表达载体p GEX-4T-3/Ci GAPDH,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达,结果大肠杆菌成功表达了r Ci GAPDH蛋白。用抗r Ci GAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析,结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然Ci GAPDH蛋白,其表观分子质量为37.3 ku,与根据氨基酸序列推算的理论值相符;实验表明r Ci GAPDH蛋白具有很好的免疫原性,而且Ci GAPDH在生活史的各阶段均有表达,符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然Ci GAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位,结果表明天然Ci GAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内,且在胞口位置分布最多。对Ci GAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。