除草剂草丁膦抗性基因bar作为三角褐指藻基因工程选择标记的研究

研究了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)对氯霉素、卡那霉素、青霉素、链霉素、潮霉素5种抗生素和一种除草剂草丁膦的敏感性,发现三角褐指藻对草丁膦非常敏感,用统计学分析法得出了其72h半致死质量浓度为22mg/L。通过基因枪法将携带草丁膦抗性基因bar的载体pSVB导入三角褐指藻细胞中,通过草丁膦筛选成功获得了抗性藻细胞,PCR检测获得阳性结果,提示草丁膦更适合用于构建安全、高效、廉价的三角褐指藻表达系统。     

裙带菜配子体基因工程选择标记的研究

研究了裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体对除草剂草丁膦的敏感性以及温度对草丁膦处理效果的影响。结果表明,裙带菜配子体对草丁膦敏感;统计学分析得出了草丁膦在不同温度条件下处理裙带菜配子体的半致死浓度(LD50)及95%可信限;温差达到10℃时,相同处理时间各组内不同处理温度样品的LD50之间呈现显著差异,第6天的LD50由10℃组的15.78 mg/L降为20℃组的11.56 mg/L和25℃组的10.33 mg/L。研究发现可以尝试采用草丁膦作为裙带菜配子体遗传转化的选择试剂。     

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)基因工程选择试剂的筛选

采用细胞计数法，研究了重要经济微藻——雨生红球藻对10种基因工程常用选择试剂的敏感性。结果表明，雨生红球藻对除草剂草丁膦和抗生素Zeocin比较敏感，50μg／ml的草丁膦和25μg／ml的Zeocin可明显地抑制雨生红球藻生长，尤其是50μg／ml的草丁膦能导致细胞两周内全部死亡；高浓度的卡那霉素和硫酸链霉素也可抑制雨生红球藻的生长；雨生红球藻对包括氯霉素和G418在内的其他6种试剂不敏感，即使处理浓度高达1000μg／ml。本文结果提示草丁膦可能是雨生红球藻基因工程适宜的选择试剂，其相应的抗性基因bar可能成为雨生红球藻遗传转化的选择标记基因。     

2017年绿潮浒苔(Ulva prolifera)生理特征及孢子囊形成情况分析

近几年来在我国青岛海域连续暴发的浒苔绿潮造成了巨大的经济损失并且破坏了近海海洋生态系统平衡。因此,浒苔绿潮受到了越来越多的关注。本研究重点关注了绿潮暴发期间不同海域浒苔藻体生理特征和孢子囊形成情况。研究发现,不同海域里浒苔藻体生理特征差异显著,孢子囊比例显著不同,并且观察到漂浮浒苔的原位萌发。2017年5月中旬,我们在苏北浅滩紫菜养殖区域(33.78°N,121.29°E)对筏架绠绳上生长的绿藻,退潮后滩涂散落的绿藻和涨潮时海面上漂浮的绿藻进行为期5天的野外采集。另外,在2017年6月随科考船对浒苔暴发海域的浒苔样本进行采集。采集范围在(33.5°—36.5°N, 120°—124°E)。结果表明,从低纬度到高纬度,浒苔F_v/F_m(光系统Ⅱ最大光化学量子产量)值从0.65逐渐降低至0.3左右;YⅡ(光系统Ⅱ实时光化学量子产量)值也从最高0.5左右降低至最低0.1。此外,定生浒苔F_v/F_m值为0.6—0.8左右,明显高于漂浮浒苔; YⅡ值也有类似趋势。在孢子囊形成比例方面,定生浒苔约有5%藻体形成了孢子囊,而漂浮浒苔中孢子囊形成比例达到20%。数据表明,低纬度区域为浒苔来源地,浒苔生理活性良好,孢子囊形成比例低。随着浒苔往北漂移,其生理活性降低。并且,漂浮浒苔孢子囊形成比例显著性高于定生浒苔。本文认为,浒苔脱离来源区后,孢子囊的快速形成、成熟和孢子释放以及孢子的原位萌发是浒苔生物量激增的重要原因。     

氮磷营养盐对浒苔生长影响的初步探讨

在实验室条件下,设置不同的N、P浓度,研究单因子(P:30μmol/L,N:0～500μmol/L和N:500μmol/L,P:0～30μmol/L)对浒苔(Enteromorpha prolifera)生长的影响。结果表明:在高N、P浓度(N:500μmol/L,P:30μmol/L)条件下浒苔生长态势最好,具有较高的相对生长率(0.451)。添加N可以明显促进浒苔的生长,而且随着添加N浓度的提高促进作用增强,浒苔的相对生长率有较大幅度提高。添加P对浒苔的生长也具有一定的促进作用,但促进作用不如添加N的明显;随着添加P浓度的提高,浒苔的相对生长率提高幅度不大,这说明浒苔生长对N变化更为敏感。     

抗生素对浒苔形态及共附生细菌多样性的影响

本文研究了3种抗生素联合处理黄海绿潮浒苔(Ulva prolifera)形态及共附生细菌多样性的影响。将浒苔放散的配子加入到含有3种广谱抗生素(青霉素G、硫酸新霉素、多黏菌素B)的培养液中进行培养, 与对照组相比, 发现浒苔幼苗生长速度缓慢, 且细胞变小, 藻体无法形成正常形态。进一步采用16S rDNA高通量测序分析抗生素处理藻体前后的共附生细菌多样性, 发现抗生素处理后浒苔共附生细菌丰富度和多样性降低, 其中Maribacter丰度降低。将藻体与形态发生化合物thallusin(Maribacter spp. 提取物)共培养, 发现thallusin可促进藻体形态恢复和生长, 推测抗生素可通过抑制Maribacter等细菌从而影响浒苔形态和生长, 这将为浒苔共附生细菌功能的深入研究奠定一定基础。     

两种海藻提取物抗水产动物病原菌活性的初步研究

研究了两种大型海藻——羊栖菜(Sargassum fusiforme)、条浒苔(Enteromorpha clathrata)提取物对11种水产动物病原菌的抑制活性。结果显示:羊栖菜乙醇粗提物乙酸乙酯相对溶藻弧菌(Vibrio algi-nolyticus)的抑制作用最明显,抑菌圈可达21.6 mm;薄层层析表明羊栖菜乙醇粗提取物乙酸乙酯相有6条层析带,其中Rf=0.54带对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最强,抑菌圈可达13.6 mm;条浒苔乙醚粗脂对11种水产动物病原菌均表现出了较强的抑制作用,其中对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最强,抑菌圈可达24.7 mm;进一步的实验显示,条浒苔乙醚粗脂3种洗脱组分抗菌性均比粗脂减弱了,而其95%乙醇洗脱组分对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可达13.8 mm。说明利用羊栖菜、条浒苔为开发海洋药物资源提供了可能。     

孤雌生殖海带对草丁膦的敏感性

于1999年4－7月，以孤雌生殖海带为材料，运用统计学方法研究其对草丁膦的敏感性，以期得到一定剂量和时间范围内草丁膦对不同长度孤雌生殖海带的半数致死剂量（LD50）。结果表明，孤雌海带在0．5－1．6cm长度范围内，草丁膦的半数致死剂量与海带的长度不相关，而与草丁膦的剂量和作用时间相关。孤雌生殖海带对草丁膦比对氯霉素和潮霉素更为敏感。提示，bar基因有可能成为海带基因工程更为理想的选择标记基因。     

浒苔光照和盐度胁迫响应基因UpMYB44的克隆与表达分析

为证明R2R3-MYB转录因子在浒苔响应非生物胁迫例如盐度和光照的过程中发挥的重要调控作用,利用实时荧光定量PCR、酵母双杂交系统、亚细胞定位等技术,研究获得了浒苔UpMYB44基因1 437 bp的开放阅读框(ORF)全长序列,编码478个氨基酸,属于典型的R2R3-MYB转录因子并通过烟草叶片转化确定其定位于细胞核,UpMYB44参与浒苔响应光照和盐度的胁迫过程,其中在低光和高盐胁迫下UpMYB44基因的相对表达量升高。筛选出了与UpMYB44互作的UpCPP5蛋白,该蛋白与浒苔的生长和细胞分裂有关,推测UpMYB44可能通过与UpCPP5互作,形成蛋白复合体参与浒苔的增殖过程。研究为日后深入探究MYB类转录因子家族调控藻类生长发育的过程奠定了基础,同时为研究浒苔快速繁殖的机制提供了思路。     

不同发育时期海带基因工程选择标记的研究

本文以海带(Saccharina japonica)配子体、配子体克隆及幼孢子体为实验材料,研究了不同发育时期的海带对草甘膦、草丁膦、氯霉素的敏感性,经SPSS软件计算出一定时间内3种选择试剂对不同发育时期海带的半致死剂量(LD50)。结果表明:海带配子体及配子体克隆对草甘膦和草丁膦极为敏感,对氯霉素较为敏感。4d时,草甘膦和草丁膦对海带配子体的LD50分别为8.19μg/mL和19.27μg/mL,对海带配子体克隆的LD50分别为73.69μg/mL和39.08μg/mL;而氯霉素对海带配子体及配子体克隆4天的LD50则高达742.00μg/mL和701.51μg/mL。海带幼孢子体仅对草甘膦极为敏感,4d的LD50为40.93μg/mL;对草丁膦和氯霉素较为敏感,4d的LD50分别为214.51μg/mL和907.86μg/mL。该结果说明草甘膦和草丁膦适合作为以海带配子体和配子体克隆为实验材料的基因工程选择试剂,草甘膦则更适合以海带幼孢子体为实验材料的基因工程选择试剂。     

绿潮生物学机制研究

绿潮发生机制极其复杂,但其核心机理是绿潮暴发时漂浮"藻席"中的浒苔快速形成巨大生物量,涉及浒苔生物学过程对环境的响应及其生理生化基础。为此,本文在已有研究报道的基础上,对浒苔生活史研究进行了充分的理论补遗;分析了漂浮"藻席"中浒苔生长与繁殖过程,认为该过程是绿潮生物量形成的关键;阐述了浒苔孢子囊形成是对富营养化背景下海水溶解无机氮(DIN)中硝态氮高占比的响应,认为一氧化氮分子可促进浒苔营养细胞向孢子囊的转化;解析了浒苔细胞对逆境因子的响应途径与机制。基于已有的研究成果,本文对浒苔引发绿潮的生物学过程进行了理论推定。人为或自然因素使固着浒苔处于漂浮状态,形成小规模"藻席";富营养化背景下海水DIN中硝态氮占比的升高赋予了浒苔巨大的繁殖潜能,漂浮过程溶解无机碳(DIC)"充裕"和"不足"两个阶段的交替以及食藻动物啃食产生的藻片段使孢子囊形成比例大幅提升;孢子原位萌发等使释放的孢子在"藻席"中获得了附着基,个体数目随之指数增长;结合漂浮浒苔的高生长速率,"藻席"规模不断扩大,短时间内形成巨大生物量。同时,本文还对今后的绿潮研究提出一些建议,认为啃食动物在浒苔生物量消长过程中发挥重要作用,在漂浮"藻席"系统中扮演着"生态引擎"的功能,同时系统阐明浒苔孢子的原位萌发等现象的生物学机理应该是未来绿潮的重要研究内容。     

不同氮磷比值下浒苔与石莼的竞争作用研究

近年来，海水富营养化导致近海海域大型海藻过量繁殖，成为世界性的环境问题。自2007年以来，浒苔绿潮在黄海海域连续暴发，造成巨大经济损失。为探究浒苔大规模暴发与氮磷比值(N/P)的关系，及其与其他大型绿藻在不同N/P下的竞争机制，研究了浒苔(Ulva prolifera)与石莼(Ulva lactuca)在不同N/P下单独培养和共培养时的生长情况，探究了浒苔及石莼生长的变化；结合苏北浅滩海域现场N/P的调查结果，分析了浒苔绿潮暴发的可能机制。研究结果表明:(1)浒苔单独培养时，在一定范围内高N/P能促进浒苔的生长，氮对于浒苔的影响大于磷。(2)石莼单独培养时，低N/P下石莼长势最好，但改变N/P对石莼的影响并不显著。(3)浒苔和石莼共培养时，浒苔生长受到了一定限制，低N/P下浒苔生长受限更显著。(4)苏北浅滩海域高N/P更适合浒苔的生长，可能是浒苔绿潮能够大规模暴发的原因之一。     

江苏海区浒苔的营养与食品安全性分析与评价

通过对不同海区浒苔及其与紫菜之间的比较,分析评价了江苏海区定生浒苔和漂浮浒苔的营养特性。通过主成分分析可以将江苏浒苔与其他浒苔和紫菜明显区分开,说明江苏浒苔的营养具有区域一致性。江苏浒苔具有高蛋白、低膳食纤维的特点,浒苔中钙、镁含量高于紫菜,磷含量低于紫菜。江苏浒苔的必需氨基酸含量组成适合人体需要,是良好的蛋白质来源。第一限制氨基酸为甲硫氨酸,呈味氨基酸含量达到氨基酸总量的33.6%—42.9%,具有较好的呈味特性。江苏浒苔的铅、铬离子含量较高,食用风险不容忽视。     

24-表油菜素内酯对浒苔(Ulva prolifera)内源植物激素及相关生理影响

采用植物激素的微量LC-MS检测等方法,研究了24-表油菜素内酯(EBR)对宁波浒苔(Ulva prolifera)内源植物激素含量及其叶绿素荧光参数、可溶性蛋白和糖含量、抗氧化酶活性等的影响。结果表明,浒苔体内含有吲哚乙酸、赤霉素、玉米素、反式玉米素核苷、异戊烯腺嘌呤核苷、茉莉酸等多种促生长性内源植物激素,但不含有异戊烯腺嘌呤。内源植物激素对24-表油菜素内酯的响应程度不同,大多数植物激素在处理第1天含量变化最快。低浓度24-表油菜素内酯处理时,各种内源植物激素的含量增高,均呈现先升高后降低的趋势。0.2 mg/L 24-表油菜素内酯处理组的效果最明显。在该浓度下,24-表油菜素内酯对生长相关激素含量、最大光能转化效率(Fv/Fm)和相对电子传递速率(ETR)、可溶性蛋白和可溶性糖含量、POD活性等均有较大的促进作用;在0.1 mg/L 24-表油菜素内酯处理组中,浒苔的体外抗氧化能力最强。     

黄海浒苔漂移输运模式的建立与应用

本文利用NCEPGFS预报风场和中国近海高分辨率三维MASNUM海浪-潮流-环流耦合海洋数值预报系统的预报数据,建立黄海浒苔漂移输运模式,用于黄海浒苔溯源和漂移输运数值模拟研究。使用2009年5月份黄海表层漂流浮标数据和2012年MODIS卫星遥感浒苔漂移分布资料对所建立的漂移输运模式进行验证,结果表明所建立的模式能够有效的模拟出浒苔暴发区漂流浮标运动状况,并能够有效地模拟出2012年浒苔漂移输运过程。最后运用所建立的模式开展2008年和2010年浒苔漂移输运过程,模拟结果与文献报道的卫星观测结果一致。模拟结果表明,受海洋表层流影响两年浒苔特征显著不同:2010年浒苔影响海域明显小于2008年,且2010年浒苔主体没有大规模在青岛近岸堆积。     

细胞的氧化还原状态对浒苔孢子囊形成的影响

浒苔(Ulva prolifera)是我国黄海海域绿潮暴发的主要成因种,其孢子囊的形成和孢子的释放是浒苔大量、快速增殖的基础。本文以浒苔为研究材料,比较分析了还原剂(DTT)和氧化剂(H_2O_2)对直径为1 mm的圆形藻片从营养细胞形成孢子囊过程的影响。研究结果表明,DTT对浒苔孢子囊的形成具有明显的抑制作用,用H2O2处理的浒苔藻片与对照组相比没有显著性的差异,因此浒苔细胞处于还原状态时不利于孢子囊的形成。研究结果为探究浒苔孢子形成的调控机制提供了科学依据。     

苏北浅滩筏架附生绿藻群落结构变化及与环境因子的相关性探究

苏北浅滩是研究浒苔绿潮早期形成机制的重要区域,该区域紫菜养殖筏架上附生绿藻的群落结构变化对浒苔绿潮的发生具有重要影响,环境因素在其中发挥了重要作用.为了探明导致苏北浅滩绿藻群落结构变化的主要环境因素,本文通过分子生物学和种群生态学方法对筏架附生绿藻群落结构进行了研究,结果表明:(1)苏北浅滩筏架附生绿藻群落主要由浒苔(...     

紫菜养殖筏架上定生浒苔对黄海绿潮的贡献

Green tides caused by the unusual accumulation of high floating Ulva prolifera have occurred regularly in the Yellow Sea since 2007. The primary source of the Yellow Sea green tides is the attached algae on the Pyropia aquaculture rafts in the Subei Shoal. Ulva prolifera and Blidingia(Italic) sp. are the main species observed on Pyropia aquaculture rafts in the Subei Shoal. We found that U. prolifera has strong buoyancy and a rapid growth rate, which may explain why it is the dominant species of green tides that occur in the China's sea area of the Yellow Sea. The growth rate of floating U. prolifera was about 20%–31% d–1, which was much higher than Blidingia(Italic) sp. There were about 1.7 × 10~4 t of attached algae on the Pyropia aquaculture rafts in May 2012. We found that 39% of attached algae could float when the tide rose in the Subei Shoal, and U. prolifera accounted for 63% of the floating algae. Our analysis estimated that about 4 000 t of attached U. prolifera floated into the surrounding waters of the Subei Shoal during the recycling period of aquaculture rafts. These results suggest that the initial floating biomass of large-scale green tides in the Yellow Sea is determined by the U. prolifera biomass attached to Pyropia aquaculture rafts, further impacting the scale of the green tide.