两种石斑鱼及其杂种子代的分子鉴定

针对在分类上存在混淆的点带石斑鱼和斜带石斑鱼,在形态学基础上,运用mtDNA Cytb基因扩增序列分析、RAPD、AFLP等分子标记技术对两种石斑鱼的遗传关系进行了研究.研究结果表明:(1)点带石斑鱼与斜带石斑鱼的分化已达到种间水平,mtDNACytb基因序列相似度为94.4%,AFLP扩增片段的遗传相似率为0.7539;(2)两种石斑鱼存在杂交现象,RAPD、AFLP的扩增谱图中均获得亲本与子代的特异性条带,父本对杂交子代的遗传影响略大于母本;(3)AFLP标记在点带和斜带石斑鱼及其杂交子代中的遗传符合孟德尔遗传规律,可用于构建两种石斑鱼的遗传连锁图谱.研究结果将对两种石斑鱼种质资源的保护及人工繁育的可续性提供重要参考.     

4种石斑鱼的分子遗传多样性和亲缘关系的RAPD分析

采用25个引物,对海南养殖的点带石斑鱼、广东养殖的斜带石斑鱼、南海西沙野生鲑点石斑鱼和蜂巢石斑鱼的基因组DNA进行了RAPD分析,并用UPGMA法对4种石斑鱼进行聚类分析.研究结果表明:(1)野生鲑点石斑鱼和蜂巢石斑鱼群体内遗传多样性较高,多态位点比率分别为58.07%和55.65%,平均遗传杂合度分别为0.1793和0.1622,表明南海野生石斑鱼遗传变异水平较高,种质资源状况良好;而养殖的点带石斑鱼和斜带石斑鱼遗传多样性偏低,多态位点比率分别为49.70%和40.38%,平均遗传杂合度分别为0.1349和0.1135,表明石斑鱼养殖群体遗传多样性水平有所下降,应及时采取适当的保护措施.(2)4种石斑鱼种间遗传距离及聚类分析表明,点带石斑鱼与斜带石斑鱼遗传距离最近(D=0.2570);鲑点石斑鱼与蜂巢石斑鱼遗传距离次之(D=0.5146);斜带石斑鱼与蜂巢石斑鱼的亲缘关系最远(D=0.5810).(3)在8个引物中,有区分4种石斑鱼的特异性片段,可用于这些石斑鱼的鉴定.     

斜带石斑鱼不同地理群体遗传变异的微卫星分析

筛选5时可分析引物对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)台湾群体和广东群体的DNA多态性进行分析.根据电泳检测结果,平均每个引物获得4.2个等位基因,未发现群体的特异位点.获得2个群体平均观测杂合度(H_o)分别为0.672 1和0.682 6,平均期望杂合度(H_e)分别为0.647 9和0.544 4,两群体间的遗传分化系数(F_(ST))为0.011 0.统计结果表明,2个群体有着较高的遗传变异性,群体间的遗传分化程度处于多数海水鱼类的平均水平.     

4种石斑鱼染色体核型研究

以蜂巢石斑鱼(Epinephelus merra)、鲑点石斑鱼(Epinephelus fario)、点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)及黑边石斑鱼(Epinephelus fasciatus)为材料,胸腔注射PHA及秋水仙素溶液,取头肾细胞经空气干燥法制片。经核型分析,蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼核型一样,2n=48=4m 6sm 4st 34t,NF=62;点带石斑鱼与黑边石斑鱼的核型一样,2n=48=48t,NF=48。由染色体数目2n=48可知,4种石斑鱼在鱼类系统中划分为高位类;由核型组成不同,可以将4种石斑鱼分为两大类：蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼属于一大类;点带石斑鱼与黑边石斑鱼属于另一大类。此外,按总臂数多少来分,蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼为特化类群：点带石斑鱼与黑边石斑鱼为原始类群。     

蓝身大斑石斑鱼染色体核型分析

为了解蓝身大斑石斑鱼(Epinephelus tukula)的细胞生物学特征,作者采用体内注射PHA培养肾细胞法对蓝身大斑石斑鱼染色体核型进行了研究。结果表明,其染色体核型为2n=48t,属于石斑鱼属鱼类典型的高位类中原始类群,是石斑鱼属进化过程中出现较早的物种。     

封闭循环养殖系统中驼背鲈和斜带石斑鱼生长的研究

研究闭合循环水养殖条件下驼背鲈(Cromileptes altivelis)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的生长特性。经343d养殖，驼背鲈幼鱼平均体质量由24．16g增加到124．4g，平均日生长率为1．2％．体质量与养殖时间的关系式为M=32．674e^0.0048t，体质量与体长的关系式为M=0．0042L^3.6184；斜带石斑鱼幼鱼体质量由20．10g增加到490g，平均日生长率为6．8％，体质量与养殖时间的关系式为M=34．319e^0.0984t，体质量与体长的关系式为M=0．0656L^2.7102。     

云纹石斑鱼与褐石斑鱼形态比较研究

对在分类上存在混乱的云纹石斑鱼(Epinephelus moara)和褐石斑鱼(E.bruneus)的外部形态和骨骼系统进行了比较研究,结果表明:两种石斑鱼的体形和体表横带等外部形态特征非常相似,但体表斑纹不同;Fisher逐步判别法分析得出两者在可量性状,如体长/肛长、背鳍基底长/臀鳍基底长和头长/眼径,可数性状,如背鳍鳍条数、鳃耙数和幽门盲囊数等方面的差异达到极显著水平(p<0.001);两者骨骼系统均由脑颅、咽颅、脊柱、肋骨和附肢骨骼组成,主轴和附肢骨骼的形态结构基本相同,但在脑颅的眶前骨和眶后骨、咽颅的前鳃盖骨和尾舌骨、附肢骨骼的髓棘间骨以及尾下骨与尾鳍鳍条连接方式等方面存在明显差异。上述形态与骨骼差异可作为两种石斑鱼种间分类的依据。研究结果确认云纹石斑鱼和褐石斑鱼为两个不同的物种。     

云纹石斑鱼染色体核型研究

采用PHA体内培养肾细胞制片法对云纹石斑鱼(Epinephelus moara(Temminck etSchlegel))核型进行研究,表明其染色体核型为2n=2st 46t,臂数NF=50。结合已有报道,显示石斑鱼类染色体形态存在一定程度的多样性。     

鞍带石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交F1代变态发育和生长特征分析

为了深入研究鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus) (♀)×蓝身大斑石斑鱼(E. tukula) (♂)杂交F1代的变态发育及生长特征，本研究对杂交组和纯种鞍带石斑鱼胚胎发育时间、受精率、畸形率、孵化率和仔稚幼鱼生长性状(全长、体长、体高、肛前距），以及杂交组卵黄囊和油球吸收过程，第二背鳍棘和腹鳍棘生长和收缩，口径和眼裂的变化等进行了详细的观察描述和统计分析。结果显示，在水温28℃条件下，杂交组和鞍带石斑鱼受精卵分别经21 h 24 min和21 h 32 min完成胚胎发育；杂交F1代受精率、畸形率和孵化率分别是89.09%±0.08%、35.16%±5.05%和62.59%±10.70%，与纯种鞍带石斑鱼无显著性差异。根据卵黄囊、第二背鳍棘、腹鳍棘、鳞片、体色等形态变化，将其胚后变态发育分为前期仔鱼(孵化后0～6 d)、后期仔鱼(孵化后7～34 d)、稚鱼期(孵化后35～46 d)和幼鱼期(孵化后47～86 d)，前期仔鱼生长较缓慢，后期仔鱼到幼鱼期生长逐渐加快，86 d时杂交组和对照组体长分别达(60.80±0.50) mm和(51.80±0.47) mm，杂交组生长速度极显著高于对照组(P<0.01)。在胚胎发育时期卵黄囊消耗量为29.45%，油球消耗量为20.75%，卵黄囊在孵化后1 d消耗最快，达58.70%。油球在孵化后3 d消耗最快，达32.08%，孵化后第5 d仔鱼卵黄囊和油球基本吸收完毕。第二背鳍棘、腹鳍棘在孵化后29 d达到最长，分别是(8.15±0.02) mm和(5.80±0.10) mm，至47 d完全退化，变态发育完成。第一天仔鱼眼径为(0.16±0.01) mm，至86 d眼径增大22倍，第四天口裂长为（0.09±0.02） mm，至86 d增大99倍。结果表明，鞍带石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交F1代胚胎和仔稚幼鱼发育正常，而且杂交F1代与母本相比具有较显著的生长优势，本研究为两种石斑鱼杂交苗种培育、发育研究和品种改良提供了丰富的数据。     

青石斑鱼抗细胞凋亡因子DAD1的克隆及表达特征分析

抗细胞凋亡因子(Defender against cell death 1,DAD1)是一种重要的内源性细胞凋亡抑制因子.采用RACE-PCR方法,结合SMART cDNA合成方法、抑制性差减杂交技术,从青石斑鱼脾脏中克隆DAD1并研究其在正常的青石斑鱼和注射了脂多糖的青石斑鱼各组织中的表达模式.结果表明:DAD1基因cDNA全长721 bp,包含一个342 bp的完整阅读框,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白.RT-PCR半定量分析显示DAD1在正常的青石斑鱼和注射了脂多糖的青石斑鱼的脾、心、头肾、肾、肝中都有转录,在脾、肝中表达水平较高,而在肌肉中未见明显表达.DAD1在注射了脂多糖的青石斑鱼各组织中的表达量均高于正常的青石斑鱼.     

AFLP技术在笛鲷的仔鱼鉴定及其分类学上的研究

以南沙群岛采获的勒氏笛鲷(Lutjanus russelli)、黄笛鲷(Lutjanus lutjanus)、红笛鲷(Lut janus sanguineus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)、线纹笛鲷(Lutjanus lineolatus)、画眉笛鲷(Lutjanus vitta)、马拉巴笛鲷(Lutjanus malabarius)、驼背笛鲷(Lutjanus gibbus)、约氏笛鲷(Lutjanus johni)、金带笛鲷(Lutjanus vaigiensis)11种笛鲷属的后期仔鱼为材料, 进行了基因组DNA的AFLP(扩增片段长度多态性)研究,通过笛鲷仔鱼和成鱼的AFLP电泳图谱的比较分析,将这11种笛鲷属的仔鱼成功分开.研究表明,最适合的AFLP引物组合是E+AGC/M+CAA,由这11种笛鲷共扩增出132 AFLP位点,每种笛鲷的AFLP条带数为43~69,在这11种笛鲷中,共享的AFLP条带数仅为7,同一种笛鲷仔鱼和成鱼AFLP遗传相似度在90%以上.根据这11种笛鲷的Nei遗传距离对Neighboring系统进行进化分析,并且与传统的笛鲷形态分类进行了比较.分子生物学可以阐释笛鲷属鱼类的系统进化和遗传亲缘关系,对传统形态分类学加以完善和补充.     

4种养殖扇贝的群体遗传多样性及特异性AFLP标记研究

应用AFLP技术对我国4种主要养殖扇贝进行了遗传分析.虾夷扇贝、海湾扇贝、华贵栉孔扇贝、栉孔扇贝4种养殖扇贝群体中,种内遗传相似度依次分别为0.841 5,0.786 3,0.719 0和0.673 1,香侬氏指数分别为43.52,58.87,80.16和92.83,栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝的遗传多样性水平明显高于海湾扇贝和虾夷扇贝;AFLP标记共享位点分布表明,在4种扇贝中栉孔扇贝与华贵栉孔扇贝之间的共享位点最多,同时4种扇贝的种间遗传相似度也以栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝之间为最高(0.769 5),海湾扇贝和虾夷扇贝之间为最低(0.662 6),揭示所研究的几种扇贝中栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝的遗传关系最近(遗传距离为0.262 1);找到了21个种内特异性AFLP标记和种间共享标记,可用于种质鉴定和分子辅助分类.     

Genetic variation of Porphyra yezoensis by using AFLP1

Genetic variation of 11 lines of Porphyra yezoensis from the coastline of Kagoshima ofJapan, Qingdao, Nantong, Putuo and Nanji Islands of China were studied by using amplified fragment length polymorphism (AFLP).778 bands were obtained with AFLP analysis of 16 primer combinations, among which 15 were unique, about 98.07% were polymorphic. The AFLP data showed that the closest genetic distance was 0.180 between two Kagoshima samples, and the farthest one was 0.397 between Kagoshima No.1 and Nantong No.9 line. The genetic distance showed that the variation was within the inner species scope. Neighbor-joining cluster and UPGMA cluster indicated that samples from Kagoshima and Qingdao were with high similarity and either with the samples of Nantong, Putuo and Nanji Islands. P. yezoensis in China shared high genetic diversity, and the genetic distance showed positive correlation with the geographic distance.     

褐点石斑鱼脱鳞病病原菌的分离与鉴定

从海南陵水新村港网箱养殖脱鳞病濒死褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)体内分离到3 株优势菌株XC08061、XC08062 和XC08063, 经回归感染试验确定为致病菌。这3 株细菌经生化鉴定以及16S rDNA 测序分析, 确定均为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。其中, XC08061 对体长为12～14 cm 褐点石斑鱼的半致死剂量为5.8×10² CFU/g 鱼体质量。药敏试验表明, 该菌具有较强的耐药性, 在所检测的25种抗菌药物中, 仅对新生霉素、头孢噻肟、先锋必/舒巴坦、诺氟沙星、依诺沙星和庆大霉素6 种抗菌药物敏感。     

斜带石斑鱼养殖群体遗传多样性的RAPD分析

利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术分析了斜带石斑鱼Epinephelus coioides繁育亲本以及2001、2004年孵育的2批子代群体的遗传多样性。17个引物共扩增出104个位点。应用生物软件POPGENE进行统计分析,3个取样群体的多态位点百分率分别为32.69%(繁育亲本)、30.77%(2001年子代)和24.04%(2004年子代);基因多样性和香侬信息指数均为繁育亲本群体最高(0.110 8和0.167 0)、2004年子代群体最低(0.066 6和0.103 8)。通过t检验检测群体间遗传多样性的差异显著程度并根据Nei公式计算遗传相似度和遗传距离分析群体间的遗传分化。结果表明,RAPD技术具有较高的灵敏性和多态性,是分析评估斜带石斑鱼遗传多样性较为适宜的分子标记之一;人工养殖不仅使斜带石斑鱼遗传多样性逐年下降,而且目前已经降低到显著的程度,近交和遗传漂变可能是导致遗传多样性下降的2个重要因素。最后对保持斜带石斑鱼遗传多样性的养殖策略进行了探讨。     

网箱养殖石斑鱼病毒性神经坏死病流行调查

厦门海水网箱养殖石斑鱼春、夏季节暴发性疾病经过流行病学调查和病原检测，确认主要病原为病毒性神经坏死病毒，病鱼外观表现典型的神经异常症状。应用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术检测5种石斑鱼：赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）、青石斑鱼（E．awoara）、云纹石斑鱼（Emoara）、紫石斑鱼（E．lanceolatus）、马拉巴石斑鱼（E．malabaricus）.检测76条石斑鱼，检出率90％；病鱼的脑、视网膜、肾脏、肝脏、脾脏等组织均能检出神经坏死病毒（NNV），以脑和视网膜检出率最高，肾脏次之，肝脏、脾脏检出率较少，鳃未检出。     

南极大磷虾粉对点带石斑鱼幼鱼氟蓄积的影响

为研究南极大磷虾(Euphausia superba)粉对点带石斑鱼幼鱼氟蓄积和生长的影响,作者通过饲养点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)幼鱼(初始体质量为(3.50±0.30)g,体长(5.5±0.3)cm)100 d,在基础日粮中添加0%(对照组)、2%、4%和6%的南极大磷虾粉制成4组饲料,饲料中氟质量分数分别为145.81、202.71、257.53和317.60 mg/kg。结果显示:南极大磷虾粉中的氟在点带石斑鱼幼鱼组织中的分布程度,以脊椎骨和鳃中为最高,氟质量分数分别为(58.020~114.380)mg/kg和(46.029~123.874)mg/kg,其次是皮(含鳞片)((44.127~88.761)mg/kg),再次是肝((7.654~18.248)mg/kg),而肌肉中氟蓄积最低((3.352~3.999)mg/kg);脊椎骨、皮(含鳞片)和鳃中氟含量随饲养时间的延续而产生蓄积,且与饲料中南极大磷虾粉的水平呈正相关,肝中氟含量随饲养时间延续而产生蓄积,但与南极大磷虾粉的水平无相关性,肌肉中氟含量与饲养时间和南极大磷虾粉水平均无相关性;100 d时,4%组和6%组的特定生长率处于最高水平,且显著高于对照组(P0.05)。本研究表明在饲料中添加4%~6%南极大磷虾粉,对点带石斑鱼幼鱼生长具有明显的促进作用。     

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)遗传多样性的AFLP分析

利用扩增片段长度多态性技术(AFLP)分析了13个条斑紫菜品系,在80对引物中,有11对能得到重复性好的多态性扩增条带,共扩增出619条谱带,每对引物扩增带数为40—77条,并且各对引物扩增结果均显示样品间存在差异。共得到609条多态性条带,多态位点的比例高达98.38%。根据AFLP图谱计算了不同样品间的遗传距离(GD)和相似性系数(GS)。聚类结果显示,品系海安与二室间的遗传相似系数较高而聚合在一起,不同样品间的相似性系数介于0.595—0.845之间。结果表明,条斑紫菜的遗传多样性极为丰富,而部分材料间的遗传距离有随地理间距增大而逐渐增大的趋势。聚类分析结果反映了目前条斑紫菜养殖品种间存在着相互混杂。