中国对虾人工诱导雌核发育的研究Ⅰ──四步诱导法

１９９０￣１９９３年于青岛采用研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的方法－紫外线照射精子、受精、温度或细胞松胞素Ｂ处理卵子方法，对中国对虾进行人工雌核发育的研究。实验结果，有三批材料获得较好的效果；二批培育到蚤状幼体，另一批培育到３￣３．５ｃｍ幼虾。经受精细胞学观察，被照射的精子经受精，其核有的不能原核化，有的虽能原核化，且能向中央迁移，但都不能与卵原核结合。实验表明，这三批育出的个体是雌核发育的个体。     

人工诱导雌核发育牙Ping的染色体及核型证明

于１９９４￣１９９６年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的３－５龄牙Ｐｉｎｇ亲鱼,采用紫外线照射法使牙Ｐｉｎｇ精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙Ｐｉｎｇ。原肠期采用空气干燥法、Ｇｉｅｍｓａ染色,得到雌核发育二倍体,正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙Ｐｉｎｇ的雌核发育二倍体和正常二     

紫贻贝雌核发育二倍体的人工诱导研究

采用紫外线照射的方式使精子遗传物质失活,通过细胞松弛素B(CB)的处理来抑制受精卵第二极体的释放,人工诱导紫贻贝(Mytilus gallopovincialis)雌核发育二倍体。将精子在强度为2561μW/(cm~2·s)的紫外线(254 nm)下进行时间梯度的照射,之后与正常的卵子受精,实验发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和D形幼虫发生率总体呈下降趋势,在照射55 s时D形幼虫发生率降为0。受精后25 min,用浓度0.5μg/mL的细胞松弛素B(CB)持续处理受精卵20 min,诱导出紫贻贝第二极体抑制型雌核发育二倍体。通过微卫星分析鉴定所得的子代个体均为雌核发育二倍体。     

雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达

于1998年4、5月在山东省荣成市寻出水产公司养鱼场人工采集牙Ping成熟精卵，紫外线灭活精子遗传物质，冷休克诱导，获得雌核发育牙Ping。1999年5月收集57尾雌核发育牙Ping生化样品，采用淀粉胶电泳分析了LDH、IDHP、PGM、ACP、ADH、SDH、GDH、CAT等8种在野生种群中为多态的同工酶。结果表明，牙Ping雌核发育群体的Ldh-C、Cat两个基因座位发生了重组，基因座位与着丝点之间的重组率分别为52．6％和29．8％；Idhp－1有父方基因表达现象，说明雌核发育过程中父方基因可能在分子水平整合。牙Ping雌核发育群体的多态座位比例和平均杂合度分别为7．0％和0．035，远低于野生种群；研究表明，通过抑制第二极体排出获得的牙Ping雌核发子代尚有一定基因杂合，不能用于培育纯系。     

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)雌核发育的人工诱导与鉴定

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)是我国重要的经济鱼类,具有复性染色体性别决定型(X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y)。利用紫外线(UV)灭活的同源精子通过冷休克方法诱导了条石鲷的雌核发育,筛选精子紫外灭活剂量并优化冷休克相关参数。结果表明:条石鲷精子最适的灭活剂量为80 mJ/cm2雌核发育的最适条件为授精后2 min在3～4°C水温下处理10 min。条石鲷雌核发育子代经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体,进一步利用微卫星分析表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本没有父本基因参与。对子代的性比和生长进行了比较,结果表明条石鲷雌核发育后代均为雌性,15月龄后雌核发育后代比普通条石鲷具有更快的生长速度。研究结果为条石鲷单性苗种的培育及其性别决定机制的深入研究提供基础。     

雌核发育系红鲤8305的产生及其生物学特性

于1981年,以经过γ射线或紫外线处理的近类精子作为激活源,成功地诱发兴国红鲤(cyprinus carpio)卵子的雌核发育。经两代连续雌核发育的部分后代个体进行人工转性,使之成为“生理雄性”,并以“生理雄性”个体与其同胞姐妹交配所产后代为遗传特性纯一的个体——红鲤8305。检查了LDH,EST,MDH,SOD,IDH及运铁蛋白(transferrin)的座位,发现同一个系的不同个体之间等位基因没有差别,而且各座位的等位基因都是纯合的。血清学试验表明,控制红鲤8305雌核发育系的红细胞表面抗原的基因纯合度相当高,同系个体之间的鳞片移植成活率可达89％以上,说明控制MHC基因的纯合度很高。     

大黄鱼雌核发育二倍体的人工诱导

采用紫外线照射对大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)精子遗传物质进行完全灭活,灭活后精子与卵子受精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克对单倍体受精卵进行倍性恢复,成功诱导出大黄鱼雌核发育二倍体。实验结果表明:(1)在紫外照射过程中照射剂量与大黄鱼精子和卵子受精后其成活率和孵化率呈现出明显的Hertwig效应,紫外照射时间超过2 min(剂量>2 400 ergs/mm2),可使大黄鱼精子遗传物质完全灭活。大黄鱼雌核发育诱导中精子遗传灭活的最适紫外照射时间为2.5 min(剂量为3 000 ergs/mm2);(2)冷休克法可成功抑制大黄鱼受精卵第二极体排放,诱导效果受处理时刻、处理时间和处理温度三因素的影响。综合雌核发育二倍体的诱导率、处理后受精卵早期胚胎存活率和仔鱼孵化率等因素,较适合的染色体加倍条件为23℃培育水温下授精后2 min,在3-4℃海水中处理10 min。     

中国对虾人工诱导雌核发育的研究：II.紫外线辐射对精子顶体反应和受精…

研究了３６５ｎｍ波长紫外线辐射中国对虾精子对其顶体反应和受精能力的影响，结果表明，低剂量上线辐射促进精子发生顶体反应，大剂量辐射使精子失发生顶体反应的生理机能并死亡，３６５ｎｍ波长紫外线能够透过精英和纳精覆盖，对其内精子起到杀伤作用，精液稀释液在紫外线下辐射５～８ｓ仍有部分精子具有受精能力，但胚胎在早期阶段即死亡，人工诱导雌核发育的过程中，紫外线辐射精液释液５～８ｓ可获得遗传物质失活的精子（激活源     

对照组和雌核发育牙鲆血清中睾酮与雌二醇水平的比较

采用放射性免疫方法测定和比较了人工诱导的雌核发育牙鲆（Paralichthys olivaceus）与对照组牙鲆血清中睾酮（T）和雌二醇（E2）水平。研究发现, 雌核发育牙鲆个体中的T 含量显著高于对照组牙鲆个体（P〈0.05）, 而其E2 含量则略低于对照组个体; 在雌核发育牙鲆中, 卵巢发育不正常的个体比发育正常的...     

刺参雌核发育二倍体的诱导及其早期生长发育

紫外线照射使精子遗传物质失活,用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放,诱导刺参(Apostichopusjaponicus)雌核发育二倍体。用强度为2561μW/(cm2.s)的紫外线(254 nm)照射不同时间的精子与正常卵子受精。结果发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼虫发生率逐渐降低,照射30 s时小耳幼虫发生率降为0。受精后35 min,显微镜下观察到有20%~30%受精卵排出第1极体时,用浓度0.5μg/mL的CB持续处理受精卵20 min,诱导出刺参第二极体抑制型雌核发育二倍体,雌核发育二倍体发育速度低于正常二倍体。微卫星分析表明,雌核发育二倍体诱导成功率为93.3%。     

日本日月贝Amussium japonica (Gmelin)人工育苗的初步研究

本文报道了从1982年1月至1985年2月对日本日月贝进行人工育苗的研究。试验结果说明北部湾产的日本日月贝的繁殖期为每年10月至翌年3月,繁殖盛期为每年11月至翌年1月。用人工升温方法诱导性腺成熟的亲贝,在适宜的海水理化条件下,经一定时间的潜伏期,亲贝大量排精产卵。收集精卵,进行人工授精,将受精后的胚胎,用玻璃缸进行培养,采取升温、控温、每天更换幼体培养水体一部分等技术措施,用单细胞藻类及干酵母片的水溶液,作为日本日月贝幼体的饵料,历经32天,终于培育成为日本日月贝幼贝210只。52天的幼贝,最大个体已达壳高313.90×壳长365.5微米,初步取得日本日月贝的室内人工育苗试验成功。     

人工诱导香港巨牡蛎雌核发育单倍体的研究

研究利用紫外线诱导香港巨牡蛎Crassostrea hongkongensis雌核发育的条件.结果表明,在强度为1820μW · (cm2·s)-1的紫外线(254nm)下分别照射精子0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,70,80和90s后,照射30s的实验组能够保持较高的受精率(61.6%),该组的D形幼虫发生率为0,出现"Hertwig效应".研究表明,在强度为1 820 μW·(cm2·s)-1的紫外线下照射精子30s是获得香港巨牡蛎雌核发育单倍体的适宜条件.研究还表明受精率和D形幼虫发生率随照射时间的增加而下降,遗传失活的精子与正常卵子受精后其胚胎发育至D形幼虫前期停止.经紫外线照射的精子授精后所产生的单倍体胚胎发育速度慢于正常受精所产生的二倍体胚胎,各照射组均出现非整倍体.     

中国对虾人工诱导雌核发育的研究 Ⅱ.紫外线辐射对精子顶体反应和受精能力的影响

研究了 36 5 nm波长紫外线辐射中国对虾精子对其顶体反应和受精能力的影响。结果表明 ,低剂量紫外线辐射促进精子发生顶体反应 ,大剂量辐射使精子丧失发生顶体反应的生理机能并死亡。 36 5 nm波长紫外线能够透过精荚和纳精囊盖 ,对其内精子起到杀伤作用。精液稀释液在紫外线下辐射 5～ 8s,仍有部分精子具有受精能力 ,但胚胎在早期阶段即死亡。人工诱导雌核发育的过程中 ,紫外线辐射精液稀释液 5～ 8s,可获得遗传物质失活的精子 (激活源 )。经透射电镜观察分析 ,紫外线对精子遗传物质的损伤是一种使染色质变性的化学作用。     

铜藻繁殖发育过程的研究

本研究观察了铜藻雌雄生殖托的形态、精子卵子的排放和受精卵的发育过程。研究发现,铜藻的雌雄性生殖托均为圆柱状,而雄性生殖托比雌性生殖托更加细长。生殖托发育成熟后会形成生殖孔,卵从生殖孔排出,靠粘液附在生殖托表面等待受精,且有8个核,被透明壁包围。而精子则呈放射状排列在生殖孔周围,排出的精子具有明显的鞭毛结构,游动到卵子周围完成受精过程。受精后的卵由8个核融为1个中央大核,受精卵经过多次细胞分裂后形成假根芽。然后,脱落在培养容器底部,发育成带有假根的幼孢子体。8周后生长成带有2～3个叶的幼苗,幼苗长达18 mm。     

异源精子诱导栉孔扇（Chlamys farreri）雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定

采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用石蜡切片显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察;采用荧光原位杂交（GISH）技术对担轮幼虫期胚胎进行检测。结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体（DCB）,DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;GISH检测结果显示,在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质。实验结果可为研究异精诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据。     

人工诱导雌核发育牙鲆的染色体及核型证明

于1994-1996年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的3－5龄牙鲆亲鱼,采用紫外线照射法使牙鲆精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙好。原肠期采用空气干燥法、Giemsa染色,得到雌核发育二倍体、正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙鲆的雌核发育二倍体和正常二倍体的染色体数均为2n=48,核型为48t,即48条端部着色点染色体,臂数NF=48,两者的核型设有明显差异;单倍体为24条端部着丝点染色体;在3个组别中,第一号染色体上都有一明显的次缢痕。雌核发育二倍体牙鲆的诱导率为98％。     

栉孔扇贝雌核发育二倍体早期成活与生长发育的研究

利用筛选出的精子遗传失活法和卵染色体加倍法,批量诱导出第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体个体,观测了幼体不同发育时期的成活率、发育速度和个体大小等生物学特性。结果发现,雌核发育二倍体的卵裂率、胚胎畸形率、D形幼虫发生率、孵化后3,6,9,12,15,18 d的成活率均显著低于对照组,表明栉孔扇贝基因组中可能存在大量有害隐性基因,雌核发育个体中有害隐性基因的纯合导致了成活率的显著下降。在发育速度方面,D形幼虫期之前,雌核发育二倍体个体明显低于对照组个体;壳顶期后则相反,雌核发育二倍体个体高于对照组个体。在个体大小方面,雌核发育二倍体个体在孵化后3 d前,壳长和壳高均小于对照组个体;孵化3 d后,壳长和壳高逐渐大于对照组个体。这一结果显示随着致死隐性基因因纯合而被自然排除,雌核发育二倍体的生长性状逐渐优越于正常个体,通过将这些雌核发育二倍体个体培养至成体,则可望培育出栉孔扇贝的优良品系。     

异源精子诱导栉孔扇贝(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定

采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用石蜡切片显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察;采用荧光原位杂交(GISH)技术对担轮幼虫期胚胎进行检测.结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体(DCB),DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;GISH检测结果显示,在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质.实验结果可为研究异精诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据.     

人工诱导栉孔扇贝雌核发育胚胎的SNP标记分析

利用紫外线照射灭活的同源精子,激活栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子分裂,获得雌核发育胚胎,流式细胞仪检测胚胎细胞平均单倍体率为82.5%。对获得的胚胎进行全基因组扩增,获得足量的基因分型模板,利用高分辨率溶解曲线(HRM)技术对其进行96个单核苷酸多态性(SNP)位点分型。结果显示,诱导雌核发育胚胎的位点检出率为96.27%,其中99.06%的位点分型结果与相应雌性亲本相符;单个胚胎中只表现一种等位形式的位点占91.67%~96.88%,平均为94.81%,较雌性亲本的纯合位点比例(64.25%)明显提高。本研究利用灭活同源精子诱导获得栉孔扇贝雌核发育胚胎,并利用单个胚胎的全基因组扩增产物进行基因位点分析,为扇贝人工诱导雌核发育个体的早期多基因位点检测和评价提供参考。     

魁蚶雌核发育的人工诱导

研究了魁蚶（Scapharca broughtonii）雌核发育的人工诱导条件。用强度为2561uw／（cm2．s）的紫外线（254nm）照射不同时间的精子与正常卵子受精,发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和D形幼虫发生率总体呈下降趋势,遗传失活的精子与正常卵子受精后其胚胎发育至D形幼虫前期停止。经紫外线照射...