单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其性质的初步研究

从单环刺嗌中制得单一组分的纤溶活性纤溶酶，并对其性质进行初步研究。单环刺嗌体组织液经离心，超滤，离子交换层析，凝胶过滤等方法进行分离纯化，制得单一洗脱峰酶组分，经Native-PAGE电泳分析，SDS-PAGE电泳分析和飞行质谱分析，鉴定了酶制品纯度和相对分子量，进行了体外溶血栓试验。所得纯品UFEIa水解酪蛋白的比活力为442．0 U／mg。纯化倍数为12．1倍，回收率为27．0％。UFEIa为单一组分，相对分子量约23800 Da。体外溶血栓实验表明此纤溶活性蛋白酶与蚓激酶相比具有很好的溶血栓活性。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶( UFE)是由本实验室分离纯化出的l组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活件和纤溶活性以及较好的生物安全性.根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp.该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶.     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。     

一种来自海洋细菌的血纤维蛋白溶酶的分离纯化及性质研究

利用硫酸铵分级盐析、DEAE－纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析法对由海洋细菌FE92－8分泌的纤维蛋白溶酶进行了分离纯化，结果得到SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳单一区带。性质研究发现，该酶分子量为12.6kD，等电点为7.45，琼脂糖－纤维蛋白平板法测得该酶作用的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在37℃，pH为8.0的情况下表现出很好的稳定性，温度起来50℃热稳定性较差，在碱性环境中稳定性较在酸性环境中稳定性强，阴性平板和阳性平板对比实验发现，该酶只有纤溶活性而无激酶活性，体外实验发现，该酶具有快速溶解血栓的能力。     

单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。     

纤溶酶原:结构、功能与进化

纤维蛋白溶解系统是凝血系统的重要组成部分,对于维持血液的流动性和血管的完整性起着至关重要的作用。作为纤溶系统中心组分的纤溶酶原在其激活剂的作用下转变为活性形式的纤溶酶,进而降解纤维蛋白原,并能溶解血栓。纤溶酶也参与金属蛋白酶类和脂氧合酶类激活作用,还与细胞许多迁移相关的生理和病理过程相关诸如癌症、血管增生、卵子成熟、胚胎发生、伤口愈合以及病原侵入相关。本文简要概述了纤溶酶原和纤溶酶的结构、功能及其进化的研究进展。     

单环刺螠纤溶酶UFEⅠ药效作用和免疫原性的初步研究

为评价单环刺螠纤溶酶(UFEⅠ)的抗凝血和抗血栓形成作用,并对其免疫原性进行初步研究.文中通过小鼠血液凝固时间实验和大鼠颈动脉血栓形成模型研究UFE Ⅰ抗凝血和抗血栓作用.用纯UFE Ⅰ为抗原免疫小鼠,间接ELISA法测定特异性抗体的动态变化及效价.结果UFE Ⅰ能明显延长小鼠凝血时间,有效抑制大鼠体内的血栓形成,并显著降低大鼠纤维蛋白原含量(FIB),延长活化部分凝血活酶时间(APTT).免疫原性的研究结果为UFE Ⅰ末次免疫小鼠后,产生微量特异性抗体,且抗体水平呈现先升后降的动态变化;方阵法确定了ELISA的优化条件,测定UFE Ⅰ免疫后产生的抗体效价为1∶1 280.本文研究显示,单环刺螠纤溶酶UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,在小鼠体内产生一过性抗体,但对动物机体不造成负面影响.     

利用色谱和飞行时间质谱方法分离并鉴定七鳃鳗血清中凝集素

本研究利用阳离子交换和分子筛的方法成功分离鉴定出分子量为105kDa，以多聚体形式存在七鳃鳗凝集素。实验结果表明，首先运用阳离子交换色谱方法能够将七鳃鳗血清混合组分进行初步分离，结合凝集活性鉴定方法，鉴定凝集活性最强组分存在于第二峰中。其次；利用分子筛方法将具有凝集活性组分进一步分离，最终得到分子量为105kDa左右具有凝集活性组分。结合Native-PAGE和SDS-PAGE结果表明，凝集活性组分以三聚体形式存在。同时，飞行时间质谱方法鉴定结果为凝集素（gi:13094239）。最终，体外鉴定结果表明七鳃鳗凝集素对兔红细胞和山羊红细胞均具有较强的凝集活性。七鳃鳗凝集素的分离纯化对研究七鳃鳗先天免疫防御机制和可变淋巴受体介导的适应性免疫防御机制均具有重要意义。     

海洋假单胞菌纤溶酶的酶学性质的研究

从一株海洋假单胞菌中分离制备出一种具有纤溶活性的酶 ,对其酶学性质进行实验研究结果显示 :该酶的分子量是 2 1k D,等电点是 7.4～ 7.5 ;最适作用 p H是 8.0 ,最适作用温度是 5 0℃。该酶具有降解苯甲酰 - L -精氨酸乙酯盐酸盐 (BAEE)的活性 ,酶的动力学分析表明 :Km =0 .87mmol/ L,Vmax=1.80× 10 -3 mmol/ L s-1。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶间接竞争ELISA检测方法的建立

硫醌氧化还原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase,SQR),是线粒体硫化物代谢的关键酶。本研究以生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物—单环刺螠SQR重组蛋白为材料,建立了单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法,为定量分析SQR蛋白水平表达奠定了基础。将SQR重组蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,检测效价高达1:64 000。采用免疫印迹实验,将该抗体与重组蛋白和体壁总蛋白杂交,均得到了单一的条带,表明该抗体特异性好。优化SQR间接竞争ELISA检测条件,得出最佳的抗原包被浓度为250ng/mL,一抗浓度为1∶20 000,二抗浓度为1∶12 000,此条件下建立的标准曲线检测范围为2.5～1 000ng/mL。精确度检测结果显示,批内差异在0.42%～7.27%、批间差异在2.58%～7.78%范围内,表明该条件下精确度具有良好的准确性和重复性。以上结果表明,已成功建立单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法。     

单环刺螠engrailed和hedgehog基因在体壁中的表达特征

本文采用Masson染色技术,确定了单环刺螠体壁的组织排列特征,由外向内依次为假复层柱状上皮、外环肌层、中纵肌层、内环肌层,各组织之间由发达的结缔组织连接。采用原位杂交和免疫组织化学技术,确定单环刺螠engrailed和hedgehog基因的mRNA及蛋白均定位于体壁的结缔组织中,尤以外环肌层两侧的结缔组织中阳性信号更明显。探讨了两个基因在单环刺螠体壁功能维持中的潜在作用。     

单环刺螠生殖腺的发生及雌体的生殖周期

采用组织学方法观察单环刺螠(Urechis unicinctus)生殖腺的发生、卵巢的结构及其年周期变化.结果显示:3.5cm幼螠中,原始生殖细胞迁至后肠管壁外的结缔组织膜处,并数个集群与该处的体细胞共同构成性腺原基;至4 cm幼螠,性腺初具雏形;随着个体的生长和成熟,构成卵巢的细胞不断增殖,于虫体尾部后肠腹侧形成长条形膜状的卵巢,外周为卵原细胞,中央为结缔组织,其两端分别与后肠管壁外侧和体壁内侧相连.根据卵巢的组织学和体腔液中雌性生殖细胞的细胞学特征,单环刺螠的卵巢发育可划分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期.单环刺螠生殖腺为低等的定型类型,其卵巢成熟期较生殖期早半个月.     

Enzymatic properties of UFE, a novel marine fibrinolytic enzyme

A novel potent protease, Urechis unicinctus fibrinolytic enzyme (UFE), was firstly discovered. The enzymatic properties of UFE were further investigated. As a low molecular mass protein, UFE appeared to be very stable to heat and pH. When temperature was below 50 ℃, the remnant enzyme activity remained almost unchanged, but when temperature was raised to 60 ℃, the remnant enzyme activity began to decrease rapidly. UFE was quite stable in the range of pH value from 3 to 12, especially in slightly alkaline pH value. Mn2 , Cu2 and Fe2 ions were activators of UFE, while Fe3 and Ag ions were inhibitors of UFE. Fe2 ion along with Fe3 ion might regulate UFE activity in vivo. The optimum pH and temperature of UFE were about 8 and 50 ℃, respectively. Other characteristics of this enzyme were also studied. Systematic research results are significant when UFE is applied for medical and industrial purposes.     

久效磷对单环刺螠体内几种酶活性影响的初步研究

运用冰冻切片技术和酶组织化学的方法研究了长期暴露于不同质量浓度久效磷(0,50,100,150ng/L)下的单环刺螠(Urechisunicinctus)体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCO)、碱性磷酸酶(AKP)的活性变化。实验表明,AChE在单环刺螠的体壁上呈现出较强的酶活性,活性位点处为红棕色的颗粒沉淀、并随久效磷胁迫浓度的提高显色越来越深;消化道切片上基本上没有AChE的活性。CCO在单环刺螠的体壁及肠道上都呈现出较强的酶活性,活性位点显示为棕色;肠道上,不同质量浓度组由低到高其CCO活性位点依次增多、显色也依次加深。低质量浓度久效磷(<150ng/L)胁迫对单环刺螠体内的AKP活性没有明显的影响。     

hairy和hedgehog在单环刺蜢幼虫体节形成过程中的表达特征分析

hairy作为成对控制基因参与果蝇等体节动物的体节形成;体节极性基因hedgehog是节肢动物和环节动物体节边界维持的关键基因。本研究分析了单环刺螠hairy的序列特征以及hairy和hedgehog在其幼虫体节发生过程中的时空表达特征,结果显示:单环刺螠Hairy序列中含有保守的HLH结构域、Hairy_orange结构域和四肽WRPW;其mRNA在早期体节幼虫中的表达量显著高于晚期担轮幼虫,并且定位于每个体节的边界处。单环刺螠hedgehog mRNA在体节幼虫中的表达水平显著高于早期体节幼虫,并且呈现保守的体节边界表达特征。研究结果表明,hairy和hedgehog在单环刺螠幼虫体节中的表达图式与小头虫等典型体节动物中的表达图式基本一致。     

单环刺螠GATA B2的基因克隆及表达分析

GATA家族是经典的转录因子家族,因其能特异性的与核苷酸序列T/A(GATA)A/G结合而得名。前期研究在单环刺螠(Urechis unicinctus)中筛选到GATA家族成员GATA B2与硫代谢关键酶硫醌氧化还原酶(Sulfide quinone oxidoreductase,sqr)启动子高转录活性区相互作用。为了进一步研究其是否参与硫化物代谢过程,本文鉴定了单环刺螠GATA B2基因(UuGATA B2),并分析其在成体各组织和硫化物暴露后的表达特征。结果显示:单环刺螠GATA B2的ORF全长为1788 bp,编码585个氨基酸;该氨基酸序列包含2个GATA家族保守的锌指结构域;系统进化分析显示UuGATA B2先与小头虫的GATA B2聚类,再与其它GATA4/5/6亚家族成员聚类。随后制备UuGATA B2多克隆抗体,利用Western blotting检测其在单环刺螠成体不同组织中的表达水平,结果显示其在体壁中的蛋白表达水平最高,中肠次之,后肠和肛门囊表达量较低,体腔液最低。由于sqr在硫化物暴露后的后肠中表达量最高,进一步对单环刺螠暴露在150μmol/L硫化物环境时后肠中UuGATA B2的表达进行了检测,发现其显著的响应硫化物胁迫,并在暴露12 h时含量达到最高,是对照组的2.32倍,表明UuGATA B2参与了单环刺螠硫化物应激过程。本文首次报道了GATA B2在硫化物应激中的表达特征,为后续深入探讨GATA家族在硫化物应激中的作用提供了基础数据。     

黄渤海螠虫动物（螠虫动物门）的研究

虫动物系动物界的一个小门，属真体腔原口动物。海生，世界种约１４０种，我国黄渤海目前发现４种，分隶于２目，２科，４属，其中有一新种－青岛池体Ｉｋｅｄｏｓｍａ？ｑｉｎｇｄａｏｅｎｓｅｓｐ．ｎｏｖ。现将该４种的分类、分布和生态特点记述如下：     

海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质研究

为获得高效降解卡拉胶菌株,从青岛太平角海域采集的角叉菜表面分离到1株高产κ-卡拉胶酶的海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)QY202,经硫酸铵沉淀、脱盐、DEAE阴离子交换层析等步骤从该菌株发酵液上清中分离纯化得到1种专一性降解κ-卡拉胶的κ-卡拉胶酶,并研究了该酶的基本酶学性质.结果表明该酶被纯化了23.1倍,回收率为43.9%,分子量大小为33.2 kDa.酶的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为8.0,在0～40 ℃,pH=7.0～8.0之间酶活力较稳定.酶对底物κ-卡拉胶的米氏常数Km值为1.6 mg/mL.Na~+、K~+对酶活有促进作用,而Hg~(2+)、Cu~(2+)强烈抑制酶的活性.酶解κ-卡拉胶的主产物为硫酸新κ-卡拉二糖和硫酸新κ-卡拉四糖.     

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。