合浦珠母贝人工诱导四倍体的研究

用细胞松驰素B（CB）、聚乙二醇（PEG）和静水压抑合浦珠母贝Pinctadamarlensii（D．）制第1次卵裂以及CB抑制极体形成诱导四倍体。CB抑制第1次卵裂在早期胚胎2-4细胞阶段发现四倍体,但8细胞阶段以后四倍体胚胎消失。PEG和PEG＋CB能诱导细胞融合产生四倍体,但处理组幼虫在担轮期死亡。CB抑制极体形成能诱导出较高比例的四倍体,在胚胎初期和担轮幼虫期分别占40％和30％以上。处理组幼虫进行培育,附苗后当贝苗长成4-5cm大小时通过鳃细胞染色体倍性检查,却没有发现四倍体。文中对四倍体是否能成活进行了讨论。     

用6－甲氨基嘌呤诱导贻贝四倍体胚胎

在滤过海水中以４×１０（－４）ｍｏｌ·Ｌ（－１）６－甲氨基Ｃ嘌呤（６－ＤＭＡＰ）处理贻贝Ｍｙｔｉｌｕｓｅｄｕｌｉｓ受精卵或胚胎，受精激活后５０或１２０ｍｉｎ处理２０—３０ｍｉｎ，分别抑制第一或第二次有丝分裂，以诱导四倍体胚胎。顶荧光显微观察表明，６－ＤＭＡＰ有效地抑制了第一和第二次卵裂。它使细胞核染色质分散，抑制了原核的移动和染色体的分离，并防碍卵裂沟和极叶的形成，从而诱导出四倍体胚胎。对第一次卵裂的抑制产生８２．８％的四倍体胚胎；第二次卵裂抑制产生５８．６％的四倍体胚胎。由于６－ＤＭＡＰ如此有效，而且价格便宜以及对人体无害，与沿用的化学诱导剂细胞松弛素Ｃ．Ｂ．相比，它应该可以成为双壳类软体动物染色体操作研究的理想化学诱导剂之一。     

药物诱导虾夷扇贝四倍体的初步研究

1992－2000年采用细胞松驰素B（CB）、秋水仙素、6－二甲基氨基嘌呤（6－DMAP）以及咖啡因等药物抑制虾夷扇贝第一极体（PB1）释放、PB1和第二极体（PB2）释放以及抑制第一次卵裂等方法，诱导虾夷扇贝四倍体。结果表明，CB、6－MDAP和秋水仙素抑制扇贝第一次卵裂秀发四倍体的比例低于25％；采用CB抑制PB1可有效地诱导产生四倍体，从授精后42min提前到15－22min开始处理，抑制PB1的放出有助于提高四倍体的比例，在12℃，处理开始和终止时间分别在授精后20－22min t 62-67min时（即PB2始出现时），面盘幼虫四倍体率最高，为56．5％。采用CB和咖啡因共同抑制PB1放出，未见四倍体比例有升高现象。四倍体处理组发育至面盘幼虫时间比对照组晚48h左右，处理组在受精后10d时水中仍有少量浮游的、染色体数目在21－28条之间的非整倍体畸形担轮幼虫。     

栉孔扇贝四倍体的研究Ⅰ:细胞松驰素B诱导

利用细胞松驰素Ｂ抑制栉孔扇贝Ｃｈｌａｍｙｓ（Ａｚｕｍａｐｅｃｔｅｎ）ｆａｒｒｅｒｉ受精卵的第一极体的放出和第一次有丝分裂获得四倍体。在２０℃条件下，卵子受精后１０ｍｉｎ，０．５μｇ／ｍｌ的ＣＢ持续处理１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ抑制第一极体排出，结果三倍体率和四倍体率分别为３８．３８％、３９．７５％和２８．４２％、３０．２４％；在２０℃条件下，卵子受精后１ｈ，０．５μｇ／ｍｌ的ＣＢ持续处理１０、１５、２０、２５ｍｉｎ抑制第一次有丝分裂，结果四倍体率分别为２１．３６％、２７．５７％、２８．４１％、２９．３５％。结合处理后幼虫的Ｄ形率，在抑制第一极体放出和第一次卵裂中，ＣＢ处理持续１０ｍｉｎ均为最好     

用6—甲氨基嘌呤诱导贻贝四倍体胚胎

在滤过海水中以４×１０＾－４ｍｏｌ·Ｌ＾－１６－甲氨基Ｃ嘌呤（６－ＤＭＡＰ）处理贻贝Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ受精卵或胚胎，受精激活后５０或１２０ｍｉｎ处理２０－３０ｍｉｎ，分别抑制第一或第二次有丝分裂，以诱导四倍体胚胎。顶荧光显微观察表明，６－ＤＭＡＰ有效地抑制了第一和第二次卵裂。它使细胞核染色质分散，抑制了原核的移动和染色体的分离，并防碍卵裂沟和极叶的形成，从而诱导出四倍体胚胎。对第一次卵裂     

华贵栉孔扇贝的三倍体诱导及生长比较

分别用细胞松弛素Ｂ（ＣＢ，浓度０．５ｍｇ·Ｌ（－１））和低温（１０℃）处理诱导华贵栉孔扇贝Ｃｈｌａｍｙｓｎｏｂｉｌｉｓ产生三倍体。抑制第一极体的三倍体诱导率分别达到４４．１％和３１．８％；而抑制第二极体的三倍体诱导率分别为９０．２％和７２．７％（胚胎初期检查）。ＣＢ处理组幼虫的日增长率显著超过二倍体（ｐ＜０．０１）。养殖半年后，三倍体在壳高、壳长、壳宽和体重方面均显著大于二倍体（ｐ＜０．０１）；而养殖１３个月后，三倍体的肉重和闭壳肌重分别比二倍体增加３９．５％和６７．４％。在繁殖期，三倍体在外观上没有生殖腺。     

华贵栉孔扇贝的三倍体诱导及生长比较

分别和细胞松驰素Ｂ和低温处理诱导华贵栉孔扇贝Ｃｈｌａｍｙｓｎｏｂｉｌｉｓ产生三倍体。抑制第一极体的三倍体诱导率分别４４．１％和３１．８％；抑制第二极体的三倍体诱导率分别为９０．２％和７２．７％。ＣＢ处理组幼虫的日增长率显著超过二倍体。     

抑制栉孔扇贝第一极体对受精卵染色体行为及胚胎倍性组成的影响

采用细胞松弛素B（CB）处理，栉孔扇贝（Chlamys ferreri）抑制其受精卵的第一极体（PB1），研究抑制PB1对受精卵减数分裂过程及胚胎倍性组成的影响。结果发现，抑制第一极体显著改变了受精卵的染色体行为，在第二次减数分裂过程中共发现4种典型染色体分离类型，分别是三极分离（41．7％）、二极分离（11．7％）、双二极分离（24．9％）和非同步分离（2．8％），其余的受精卵（19．0％）染色体分离行为紊乱。对4-8细胞期胚胎的倍性组成进行分析，发现处理组中含有二倍体（10．9％）、三倍体（12．5％）、四倍体（19.5％）、五倍体（12．6％）以及非整倍体（46．6％）胚胎。研究结果表明，二极分离和双二极分离分别是形成三倍体和四倍体的主要机制，而其他的染色体分离行为将主要形成非整倍体。     

异源精子诱导栉孔扇（Chlamys farreri）雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定

采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用石蜡切片显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察;采用荧光原位杂交（GISH）技术对担轮幼虫期胚胎进行检测。结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体（DCB）,DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;GISH检测结果显示,在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质。实验结果可为研究异精诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据。     

贝类四倍体育种研究进展

综述了国内外贝类四倍体育种的研究现状和最新进展。四倍体诱导的方法主要有抑制第1极体或同时抑制2个极体的释放、抑制第1次卵裂、细胞融合、人工雌核发育和利用三倍体诱导四倍体，其中利用三倍体获得四倍体是迄今报道的获得具存活力的四倍体的唯一成功方法。四倍体育种中染色体组操作的结果除了产生整倍体外，还产生大量的非整倍体。四倍体贝类存活力较低，但具有较高的繁殖力，能产生较大的生殖细胞，并能与二倍体杂交产生100％的三倍体。     

栉孔扇贝四倍体诱导效果的早期分析方法

应用流式细胞仪检测栉孔扇贝(Chlamys farreri)担轮幼虫、D型幼虫倍性组成，结合现场观察、压片观察及D型幼虫生成率分析了热休克抑制第一次卵裂(MI)诱导栉孔扇贝四倍体的诱导效果。该方法可快速、有效地分析出处理剂量、起始处理时间、处理持续时间对诱导效果的影响。从而筛选出合适的诱导指标。     

利用细胞松弛素B抑制第一极体排放诱导近江牡蛎(Crassostrea rivularis)四倍体

采用细胞松弛素B（CB）处理受精卵,抑制第一极体的排放,对近江牡蛎四倍体的诱导和培育进行了研究.结果表明,近江牡蛎在25-28℃时受精卵发育同步性较高.在28℃条件下,CB适宜处理剂量为0.6mg/L.在个别受精卵出现第一极体时实施处理,至对照组的第一极体出现率达到50%终止处理,四倍体的诱导效果较好.5个处理组D形幼虫的平均孵化率为11.0%,显著低于对照组72.4%的平均孵化率.在受精后4-12d期间处理组幼虫的存活率显著低于对照组.处理组胚胎和D形幼虫阶段四倍体的平均比例分别为41.8%和37.9%.四倍体的比例随着幼虫的生长发育呈下降趋势,至受精后12d在各处理组已检测不到四倍体.2组幼虫完成附着变态,从受精卵至稚贝的累计存活率平均为0.3%.本研究结果表明,使用CB处理抑制受精卵第一极体的释放可以有效诱导近江牡蛎四倍体,但所获得的四倍体幼虫存活力差,需要在未来的研究中解决.     

人工四倍体皱纹盘鲍的发生

采用化学药物进行诱导皱纹盘鲍四倍体的研究。结果表明,在受精后１０ｍｉｎ开始,用１ｍｇ／ｌ浓度的ＣＢ持续处理皱纹盘鲍受精卵３０ｍｉｎ,通过阻止极体释放,可获得２１．９％的四倍体胚胎。用０．０５ｇ／Ｌ浓度的秋水仙素,在受精后４０～５０ｍｉｎ的效应时间内开始处理,持续３ｍｉｎ,能抑制皱纹盘鲍的第一次有丝分裂,四倍体诱导率最高为１３．０％。此外观察到,秋水仙素对染色体组加倍最为敏感的效应时间,也是胚胎对诱导处理耐受性最弱的时期。化学药物的毒性作用和染色体的断裂或缺失,可能是导致皱纹盘鲍四倍体胚胎死亡率高的重要原因     

异源精子诱导栉孔扇贝(Chlamys farreri)雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定

采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用石蜡切片显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察;采用荧光原位杂交(GISH)技术对担轮幼虫期胚胎进行检测.结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体(DCB),DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;GISH检测结果显示,在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质.实验结果可为研究异精诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据.     

6-DMAP诱导太平洋牡蛎三倍体——4.四倍体现象的研究

１９９６～１９９７年,在进行６－二甲基氨基嘌呤（６－ＤＭＡＰ）诱导太平洋牡蛎产生三倍体的实验过程中,发现一定数量的四倍体。解剖法获取精卵,人工授精。染色体倍性鉴别采用染色体计数法。（１）三因素四水平Ｌ１６（４５）正交设计。试验平行重复２次。最高四倍体诱导率为４０．０±０．０％。太平洋牡蛎四倍体各诱导因素的最优水平组合：当精卵混合２０ｍｉｎ时,将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌＬ－１的海水中１０ｍｉｎ;决定四倍体产生的三因素的主次顺序：６－ＤＭＡＰ浓度→诱导时机→诱导持续时间。（２）三因素三水平Ｌ９（３４）正交设计。试验平行重复３次。最高四倍体诱导率为９．６±４．９％。诱导太平洋牡蛎四倍体各因素的最优水平组合：当５０％受精卵出现第一极体时,将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌＬ－１的海水中１５ｍｉｎ;决定四倍体产生的三因素的主次顺序：诱导时机→６－ＤＭＡＰ浓度→诱导持续时间。     

贻贝发育早期酯酶和过氧化物酶活性

采用组织化学和分光光度技术对贻贝(Mytilus edulis)发育早期酯酶(Esterase,EST)和过氧化物酶(Per-oxidase,POD)活性进行了研究,以探讨贝类早期发育过程中的免疫防御机制。EST和POD均存在于贻贝的卵母细胞、胚胎和幼虫中,但在各个发育时期的分布和含量不同。组织化学定位结果表明,从卵母细胞到D型面盘幼虫各个发育时期的胚胎和幼虫均呈EST强阳性和POD阳性;卵母细胞核区较大且颜色较浅;桑椹期开始出现不同细胞阳性的强弱差异;原肠胚、担轮幼虫和D型面盘幼虫细胞间阳性强弱的差异逐步增大。分光光度测定结果表明,α-醋酸酯酶活力,卵母细胞最低,受精卵略有提高,卵裂期胚胎提高较大且达最高峰,囊胚、原肠胚和担轮幼虫又逐渐下降,D型面盘幼虫下降较大;α-丁酸酯酶活力,卵母细胞较高,受精卵略有提高且达到最高峰,卵裂期胚胎到D型面盘幼虫各个时期逐渐下降,D型面盘幼虫最低。不依赖卤素POD活力,卵母细胞最低,受精卵提高较大,囊胚达到最高峰,原肠胚、担轮幼虫和D型面盘幼虫逐渐降低。依赖卤素POD活力与不依赖卤素POD活力的变化规律相似,但受精卵提高较小,而卵裂期提高较大。EST和POD可能在贻贝的发育早期抵抗病原微生物侵染方面发挥重要作用。     

海湾扇贝幼虫变态诱导研究

本文在实验室条件下研究了海湾扇贝幼虫的诱导变态。研究结果表明肾上腺素、去甲肾上腺素、ｃ－ＡＭＰ、ＧＡＢＡ、赖氨酸和ＫＣｌ等６种诱导剂中,ＫＣｌ对海湾扇贝幼虫的变态诱导效果非常显著。ＫＣｌ对幼虫的诱导效应随ＫＣｌ浓度和作用时间的增加而增大,过高浓度则抑制幼虫的变态。受精１３ｄ后幼虫（２２±１℃）才对ＫＣｌ的作用着重产生明显反应。这为生产上提供了一种方便、价廉、安全的诱导变态方法,在海湾扇贝育苗工作有很大的应用前景。     

合浦珠母贝三倍体死亡率观察

以染色体倍性鉴定方法检查合浦珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｒｔｅｎｓｉｉ三倍体处理组的４个不同发育生长期（即２—４细胞期、担轮幼虫期、６个月小苗及１４个月成员）的三倍体比例，并将同一处理组培育出的贝苗经倍性鉴定后将二倍体和三倍体分开，在海上吊养１周年，分别检查其死亡率，观察比较三倍体合浦珠母贝的死亡状况。结果表明，在胚胎发育期，三倍体和二倍体的死亡率差异不大；在直线铰合期至变态附着成为贝苗这段时期，三倍体死亡率明显高于二倍体；成贝的三倍体和二倍体死亡率没有显著差异。     

中华绒螯蟹多倍体诱导技术改进

采用抑制第二极体排放的方式对15℃孵育的中华绒螯蟹自然受精卵人工诱导三倍体,通过抑制第一次卵裂对18℃孵育的自然受精卵人工诱导四倍体,应用流式细胞仪进行倍性鉴定.分别使用CB,6-DMAP和KCl三种试剂对受精卵处理,发育至囊胚期检测,获得的最高三倍体诱导率依次是49.1%,51.7%和77.5%,获得的最高四倍体诱导率依次是50.3%,54.9%和79.8%.使用KCl试剂对抱卵蟹诱导处理,孵出潘状幼体检测,最高三倍体诱导率为85.3%,最高四倍体诱导率为27.3%.克服了以往三倍体诱导中离体培养的困难,首次获得了中华绒螯蟹三倍体潘状幼体,并极大提高了潘状幼体阶段四倍体诱导率.     

刺参雌核发育二倍体的诱导及其早期生长发育

紫外线照射使精子遗传物质失活,用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放,诱导刺参(Apostichopusjaponicus)雌核发育二倍体。用强度为2561μW/(cm2.s)的紫外线(254 nm)照射不同时间的精子与正常卵子受精。结果发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼虫发生率逐渐降低,照射30 s时小耳幼虫发生率降为0。受精后35 min,显微镜下观察到有20%~30%受精卵排出第1极体时,用浓度0.5μg/mL的CB持续处理受精卵20 min,诱导出刺参第二极体抑制型雌核发育二倍体,雌核发育二倍体发育速度低于正常二倍体。微卫星分析表明,雌核发育二倍体诱导成功率为93.3%。