RSAP标记技术在紫菜遗传多样性检测及种质鉴定中的应用

限制性位点扩增多态性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）是根据基因组内普遍存在的酶切位点来设计特殊的引物，通过简单的梯度PCR反应来产生多态性。本研究首次将RSAP标记技术成功应用于紫菜遗传多样性检测和种质鉴定。利用所建立的适合于紫菜RSAP分析的PCR反应体系和反应条件，使用30对引物对15个紫菜系DNA进行了PCR扩增，经过3次重复验证，有12对引物能够扩增出清晰且稳定的条带。这12对引物共扩增出413条带，其中408条为多态性条带，多态性比例96％，平均每对引物产生34条多态性条带，片段大小在50-500bp之间。利用这413条带进行聚类分析，产生了这15个紫菜系的进化树。15个紫菜系在0.69相似系数水平上分为两大类：一类包括坛紫菜；另一类包括条斑紫菜和少精紫菜。选2对引物R1／R6和R3／R4所扩增的10条稳定且重复性好的条带，构建了这15个紫菜系的RSAP-DNA指纹图谱。在该指纹图谱中，每个紫菜系都有其独一无二的指纹模式，能够很容易地与其它紫菜系相区分。     

电洗脱法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因组测序DNA样品纯化中的应用

紫菜腐霉(Pythiumporphyrae)是一种专性侵染紫菜并引起紫菜赤腐病的病原菌。为了深入了解紫菜腐霉的遗传信息,本文计划对其开展全基因组测序,而制备高质量的DNA样品是关键性工作。海洋生物生境和代谢的特殊性,细胞中富含的一些次级代谢物质往往影响着DNA样品的质量。紫菜腐霉的基因组DNA样品中具有严重的RNA污染,即使通过延长RNase A降解时间和增加降解次数也不能完全消除其中的RNA,无法获得满足于PacBio文库构建和测序的DNA样品。本研究首先通过琼脂糖凝胶电泳(Agarosegel electrophoresis,AGE)来区分DNA和RNA,然后将DNA条带所在的胶块切下并放入透析袋中继续电泳,使DNA从胶条中迁移到透析袋内的缓冲液中,从而获得DNA的TAE溶液。然后通过透析的方法去除DNA的TAE溶液中的乙酸钠,最终获得DNA的TE溶液。经AGE检测发现DNA条带清晰、无RNA污染;经脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)检测发现DNA完整性较好,可用于PacBio文库的构建和测序。     

用于紫菜无性系种质鉴定的计算机化DNA指纹的建立

研究用RAPD技术对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)、坛紫菜(P.Haitanensis)、半叶紫菜(P.Katadai var.Hemiphylla)和少精紫菜(P.Oligospermatangia)的15个无性系丝状体进行了遗传多样分析,用120个Operon引物进行了筛选,从中选用来自OPJ-18和OPN-02扩增出的8条多态性条带构建了这15个紫菜无性系的DNA指纹图谱,在该图谱中每个紫菜无性系均有各自特异的DNA指纹.用1和0分别表示DNA带的出现和缺失,将各个无性系的DNA指纹用计算机语言表示,建立了15个紫菜无性系的计算机化DNA指纹;在此基础上设计了紫菜无性系种质鉴定的计算机软件PhGI.     

条斑紫菜丝状孢子体cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定

经过微量总 RNA抽提、c DNA合成、c DNA扩增和克隆等步骤 ,构建了微量条斑紫菜丝状孢子体 c DNA文库 ,并进行了小规模表达序列标签分析。从 1 70条标签序列中鉴定出 6条抗病相关基因序列。这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记 ,辅助紫菜抗性遗传改良。     

钝顶螺旋藻基因组质粒文库的构建及其在获得功能基因上的应用

利用改良的SDS法提取钝顶螺旋藻基因组DNA，经Sau3AI酶切，回收1～2kb大小的片段，与BamHI（Sau3AI的同尾酶）酶切并去磷酸化后的pBR322质粒载体相连接，转入大肠杆菌（Escherichia coli）Top10细胞，构建了螺旋藻基因组质粒文库。根据pBR322载体上多克隆位点两侧序列设计锚定引物，根据丝状蓝藻丝氨酸／苏氨酸激酶（STK）保守序列设计简并引物，以螺旋藻质粒文库为模板，“巢式”扩增出了STK基因部分序列。螺旋藻基因组质粒文库的构建为功能基因研究提供了极大方便。     

海带雌性配子体克隆细胞的超低温保存实验

生物种质资源保存的超低温冷冻保存技术在国内外已进行了广泛的研究[1],在藻类种质保存工作方面,绿藻、硅藻、蓝藻[2~6]以及紫菜[7~9]的超低温保存工作也取得了良好的进展.海带配子体(克隆)是一种以有丝分裂方式进行细胞增殖的微小藻体,并可通过两性生殖或单性生殖发育成大型叶状体.     

坛紫菜微卫星DNA序列的筛选

自坛紫菜(Porphyrahaitanensis)丝状体中提取的DNA,经Sau3AI限制性内切酶消化后,将300~900bp之间的DNA片段回收,并连接到经BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体上,最后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,构建坛紫菜小片段DNA质粒文库。选用pUC18质粒的通用引物进行PCR反应,对文库进一步筛选并检测插入片段的大小,在384个阳性克隆中,有278个含有大小合适的插入片段。经测序及序列分析,在103个克隆中获得172个微卫星序列,其中完美型107个,占62.2%,非完美型53个,占30.8%。(GC)n与(CG)n在坛紫菜DNA中非常丰富,分别占25%及17%,但重复频率相对较低。     

紫菜育种的困难与对策分析

紫菜是紫菜属（Porphyra）大型红藻总称。紫菜广泛分布于寒带到亚热带的潮间带。中国北到辽宁南至海南都有分布。中国栽培紫菜主要是坛紫菜（南方）和条斑紫菜（北方），只在浙江两种紫菜都有栽培。目前，中国紫菜育苗亲本基本上采自野生群体或未经遗传改良的栽培群体，遗传纯合紫菜品种（系）培育和栽培多处在实验研究阶段。在面临病害频发及产量、质量下降等问题的情况下，为保障中国紫菜栽培业持续健康发展，系统的紫菜育种迫在眉睫。但是，紫菜栽培只有几十年的历史，其育种还处在初级阶段，另外，紫菜的生物学特性不利于育种。作者对紫菜育种的困难进行了分析并探讨了紫菜育种的方法学对策。     

植物激素在条斑紫菜原生质体固体培养中的作用

利用酶解技术制备高活力的条斑紫菜原生质体；通过优化原生质体的制备工艺和培养条件，建立了条斑紫菜原生质体的无菌培养体系，同时首次证明了高等植物组织培养中常用的两种激素NAA和6－BA对紫菜细胞生长具有明显地促进作用，并应用这两种激素建立了条斑紫菜原生质体的固体培养方法，为开展紫菜遗传转化中阳性克隆的定向筛选，以及探讨紫菜的基础生理生化反应机制奠定了良好基础。     

坛紫菜原生质体的超微结构观察

在细胞与原生质体的分离培养与融合的研究中,利用电子显微镜观察高等植物细胞去壁情况、原生质体再生壁的形成过程以及原生质体融合后细胞内细胞器的变化已经是比较普遍采用的手段。但在大型海藻细胞分离与培养方面的研究工作中,利用这一手段进行研究的并不多见。 我们在研究Ⅰ中曾经利用海螺酶解离坛紫菜的营养细胞并成功地培养成紫菜叶状体,但是解离成单离细胞去壁情况如何,当时     

分子标记在纤毛虫原生动物系统学研究中的应用

综述同工酶、RFL P、RAPD、SAP、AFL P及序列测定技术在纤毛虫原生动物系统分类学研究中的应用。相较传统的形态分类学 ,分子标记可以从基因和分子水平上提供可靠而丰富的依据。作者就分子标记在该类动物系统分类学研究中的意义及现状作了回顾 ,并就其应用前景进行了探讨。     

紫菜减数分裂的研究现状及展望

紫菜的减数分裂是紫菜育种和遗传研究的重要理论基础。文中综述了紫菜减数分裂的研究现状,对前人在减数分裂的细胞形态学观察、色素突变体和性别决定的遗传分析研究进行了系统的分析,指出了研究中存在的问题。并对减数分裂这一遗传现象进行了重新认识,提出紫菜减数分裂可能发生在壳孢子形成至壳孢子萌发的第一次细胞分裂时期。根据对文献资料的分析及初步研究,认为紫菜减数分裂的争论问题,还未得到满意的解决,因此仍有重新认识和深入研究的必要。     

紫菜分子遗传学研究进展

紫菜因其重要的经济价值和独特的生物学特性而颇具研究价值。近年来,紫菜遗传学研究随着分子生物学技术的进步得以迅速发展,本文从分子标记技术在紫菜遗传学中的应用以及紫菜基因组的研究两方面对紫菜的分子遗传学发展现状作一综述。     

几种紫菜种质资源遗传多样性的RAPD分析

用随机多态DNA(RAPD)标记方法对11个紫菜(Porphyra)样品进行遗传多样性检测,从46个随机引物中筛选出27个有效引物,共扩增出282条DNA带,其中多态位点224个,占79．4％。用类间平均链锁法对各样品间的遗传距离进行聚类分析。结果显示,2个条斑紫菜之间的亲缘关系很近,遗传相似系数达98．1％,和坛紫菜的亲缘关系较远;坛紫菜不同样品间的遗传相似系数在75．8％～90．6％之间,表明坛紫菜种质资源具有丰富的遗传多样性,是良种选育的遗传基础。     

条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的提取

提取条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的新方法。先用海螺酶处理紫菜叶状体制备细胞,然后用SDS-蛋白酶K裂解细胞提取总DNA,再用玻璃粉浆(glassmilk)对其纯化,经纯化后的总DNA能被EcoRI,Dral与HaeⅢ等限制酶完全酶切,并在酶切图谱上形成明显的DNA带型。当用异硫氰酸胍一十二烷基肌氨酸钠裂解紫菜细胞时,在总DNA提取物中直接发现有一条质粒状DNA带(2.3Kb),即建立了一种极简便的质粒状DNA提取方法。     

Identification of Porphyra lines using computerized DNA fingerprinting

ImpIONPorghyra is one of the most important rnarine a1gae with glObal distribution and importanterenomic value. AIthOtJgh the yield of POrPhpo is lower than that of kelp, the output valueof Porghpp occupies the first place in rnarine algae in China. The traditional taxonomy ishanly had on the morpbolOgical characteristics, such as the morpbobeical traits size, rnar-gin celIs and the number of repnductive cells. However, most of morPhobeical traits are af:fected by environrnntal factOrs …     

坛紫菜品系间遗传差异的RAPD分析

利用RAPD技术对六个坛紫菜品系进行了研究,从107条随机引 物中筛选10条随机引物,一共扩增出93条可重现的片段。经统计分析,六个品系间的遗传相 似系数在0.246～0.636之间。其中浙江北部沿海栽培品系间的相似系数最高为0.636.地 域间品系的遗传相似系数最低为0.246。六个品系用UPGMA方法得到的聚类关系符合传统的地 域和表型关系。通过对照品系间有稳定差异的DNA条带,表明RAPD标记是坛紫菜品系鉴定和 遗传多样性分析的有效手段。     

分子遗传标记技术在双壳贝类研究中的应用

分子遗传标记是随着分子生物学技术的发展而出现的遗传学标记技术,它突破了形态和细胞水平上遗传标记的局限性,发挥着独特的优势.分子遗传标记目前已出现了几十种,本文主要介绍了同工酶、RFLP、SSR、RAPD这几种常用的分子遗传标记方法在双壳贝类的分类学、遗传多样性研究、遗传育种研究、病理学研究等方面的应用.通过本文可以看出,分子遗传标记多应用在分类学、遗传多样性、遗传育种方面,涉及的种类较广,但主要集中于珠母贝和牡蛎的研究上.     

海洋浮游甲壳类分子系统学研究进展

回顾海洋浮游甲壳类系统学研究的基础上，综述了生化水平和DNA(mtDNA和核DNA)水平的分子系统学研究现状。分子标记中DNA序列分析最为常用，其次是RFLP和RAPD分析，mtDNA主要应用于分类学、群体遗传学、种间分子进化和系统发育重建研究，而核DNA则应用于科以上较高阶元的系统发育和种内、近缘种间的遗传结构和遗传分化研究。最后对存在的问题和应用前景进行了展望。