大菱鲆血清免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备及其特性分析

本研究运用硫酸铵盐析法结合Protein A亲和层法从大菱鲆血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。SDS-PAGE分析结果显示,纯化的血清IgM主要有2条蛋白带,分子量分别为78和27kDa,分别为大菱鲆IgM的重链与轻链。以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,将融合后的细胞置于含HAT的培养基中培养。利用ELISA和Western blotting筛选杂交瘤,并利用有限稀释法对阳性杂交瘤进行单克隆,最终共获得3株抗大菱鲆血清IgM单克隆抗体,分别命名为1B2、1G4和2A1,抗体分型结果显示3株单抗均属IgG。Western blotting结果显示,单抗1B2和1G4可特异性识别大菱鲆IgM重链蛋白,而单抗2A1则特异性识别轻链蛋白。同时,以制备的腹水单抗1G4结合免疫荧光检测显示,单抗1G4可识别大菱鲆外周血、脾及前肾组织中表面IgM阳性(sIgM~+)细胞;流式细胞术分析显示,大菱鲆外周血、脾和前肾白细胞中sIgM~+细胞比例分别为48.07%,20.05%和18.45%。研究结果显示,制备的抗大菱鲆血清IgM单抗特异性高、反应性强,可为研究大菱鲆免疫系统及免疫应答动态提供有力的工具。     

花鲈、许氏平鲉游泳能力的初步实验研究

实验利用小型海水循环水槽测定了花鲈（Lateolabrax maculatus）、许氏平（鱼由）（Sebastes schlegeli）的最大巡航（可持续）游泳速度.体长18～29cm的花鲈,其最大巡航游泳速度为41.1～127.37cm/s,如用单位时间内游过体长的倍数（BL/s）来表示,其最大巡航游泳速度范围在2.28～4.74BL/s之间.体长10～14.5cm的许氏平（鱼由）,其最大巡航游泳速度为36.90～49.52cm/s或4.32～3.01BL/s.     

利用鱼抗血清及鼠抗血清分析鱼肠道弧菌全菌蛋白抗原性

从患腹水症牙鲆脾脏组织中分离得到一株优势菌株CD86,经人工感染实验证实菌株CD86对牙鲆有较高的致病力,其半致死浓度为1.8×105 CFU/尾。通过生理生化特征测定和16SrDNA基因序列分析,判定菌株CD86为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。以福尔马林灭活的菌株CD86全菌分别免疫健康的小鼠和牙鲆,ELISA测定鼠抗血清和牙鲆抗血清效价分别为12 800和1 200。利用间接免疫荧光技术检测2种抗血清与菌株CD86的结合活性,结果显示,2种血清均可同菌体发生阳性反应,其中鼠抗血清阳性反应信号明显强于鱼抗血清。同时,利用Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性,结果显示分子量为27、30和37kDa的菌体蛋白条带与2种血清均发生阳性反应;分子量为19、25、28、29和35kDa的菌体蛋白条带仅与鼠抗血清发生阳性反应;分子量为45kDa的菌体蛋白条带只与鱼抗血清发生阳性反应。研究结果表明,牙鲆对菌体抗原产生的抗体应答与小鼠存在明显差异,该发现对研筛鱼用高效的鱼肠道弧菌亚单位疫苗具有重要的参考价值。     

抗紫红笛鲷血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备

采用蛋白A－sephrose亲和层析法，分离提纯了紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus的血清免疫球蛋白（Ig)，并制备了抗紫红笛鲷血清Ig分子的单克隆抗体。经间接ELISA，免疫印迹（western blotting)的检测和鉴定，得到抗紫红笛鲷Ig分子重链的单抗6株，分别为IgG11株，IgG23株，IgG2a1株，IgG31株。这6株抗紫红笛鲷Ig的单抗各有1株与同为鲈形目的青石斑鱼Epinephelus awoara和尖吻鲈Lates calcarifer的Ig分子有很弱的交叉反应，而同鲽形目的牙PingParalichthys olivaceus的Ig分子没有交叉反应，具有较强的种间特异性；同时揭示，同目不同属的鱼类血清Ig之间的相似度较低，不同目之间的相似度极低。     

体内受精许氏平鲉(Sebastes schlegelii)和体外受精大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子结构及生理特性比较

为了解硬骨鱼许氏平鲉精子体内受精以及精子在雌性体内保持长期存活的特性，本研究应用扫描电镜与透射电镜对体内受精卵胎生硬骨鱼许氏平鲉与体外受精卵生大菱鲆的精子进行超微结构观察，并使用计算机精子分析系统比较精子激活后运动参数差异。结果显示，这两种鱼的精子均由头部，中段和尾部构成，无顶体，尾部轴丝为“9+2”微管结构。许氏平鲉精子特点：头部呈短棒状，细胞核呈长锥状；中段不对称，约30—40个线粒体呈垛叠状紧密排列在中段；轴丝质膜延伸形成的侧鳍较为发达。大菱鲆精子特点：头部呈椭圆形，头部和鞭毛结构松散，含有大量囊泡状结构；精子中段较短，向外突出的线粒体包裹鞭毛形成“半袖套”结构且尾部鞭毛侧鳍不发达。许氏平鲉精子密度和体外激活寿命均显著高于大菱鲆精子，而激活后精子的平均曲线速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）、平均路径速度（VAP）显著低于大菱鲆精子。研究表明，上述精子结构差异主要表现在精子头部与中段：体内受精硬骨鱼精子大多具有细长的头部，发达的中段，线粒体数量较多；体外受精硬骨鱼具有圆形或椭圆形的头部，中部不明显，线粒体较少。     

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的外套膜蛋白质的双向电泳研究

采用双向电泳技术,对浙江乐清无花纹和有花纹文蛤外套膜的全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析。经PDQuest软件分析,在pH4—7,分子量14.3—200kD之间,无花纹文蛤样品中检测到682±24个蛋白质点,有花纹样品检测到600±35个蛋白质点,平均匹配率为84.5%。研究结果显示,两种文蛤共有256个点存在差异表达,这些差异点可能与贝壳的颜色和花纹形成有关。其中98个点为无花纹文蛤特有,57个点为有花纹文蛤特有,另有101个点在表达量上存在两倍以上差异。在无花纹贝壳中发现分子量为42kD左右,等电点为6.4左右,与库蚊的肌动蛋白(分子量为41.7kD,等电点为5.3)匹配率较高;分子量为29kD,等电点为5.6,与飞鱿的肌动蛋白(分子量为29kD,等电点为5.25)匹配率较高的两个蛋白质。在有花纹文蛤中发现了分子量为27kD左右,等电点为4.8,与丽文蛤属的肌浆钙结合蛋白(分子量为20.8kD,等电点为4.98)匹配率较高。     

大菱鲆生长激素基因cDNA的克隆、序列分析及分子系统研究

为了从分子水平研究大菱鲆生长激素作用机制及进化机制.以大菱鲆(Scophthalmus maximus)为材料从脑垂体中提取mRNA,利用SMART-RACE技术建立大菱鲆脑垂体cDNA文库,并从该文库中克隆出大菱鲆生长激素(growth Hormone,GH)cDNA全长序列.测序结果表明,克隆的大菱鲆GH cDNA序列全长为876 bp,包括108 bp的5'UTR和174 bp的3'UTR序列.该基因的开放阅读框全长591 bp,编码由197氨基酸残基组成的生长激素成熟肽序列,用生物软件DNASTAR计算大菱鲆生长激素蛋白分子量为1*!909.22,等电点为6.24.将大菱鲆与漠斑牙鲆、褐牙鲆等共7种鲆鲽鱼类GH成熟肽氨基酸序列进行比较分析,结果显示大菱鲆与其他6种鲆鲽鱼类序列同源性均为70%左右,而鲆科鱼类与鲽科鱼类间生长激素基因同源性很高(≥80%),说明大菱鲆与鲆科、鲽科鱼类的同源性较低.另外,运用PAUP软件对7种鲆蝶科鱼类与另外8种不同种属鱼类进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致,大菱鲆单独形成1个分支且与鲆科和鲽科鱼类相距较远,此结果为在形态学分类基础上进一步定义菱鲆属鱼类分类提供了理论依据.     

牙鲆淋巴囊肿病毒靶器官上病毒结合蛋白的鉴定

利用抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的间接免疫荧光检测技术,在患淋巴囊肿病牙鲆的表皮、鳃、胃、肠及肾中发现淋巴囊肿病毒的感染,以此确定为病毒感染的主要靶器官。用NP-40细胞裂解液分别抽提靶器官的总蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)对靶器官上淋巴囊肿病毒结合蛋白进行鉴定,结果显示在胃、肠及肾的组织蛋白中均有1个分子量为27.8 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合,在鳃和表皮的组织蛋白中分别存在分子量为37.6 kDa和56.0 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合。推测在淋巴囊肿病毒靶器官上的这3种病毒结合蛋白有可能是病毒的受体蛋白。     

4 种病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

利用十二烷基磺酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、河口弧菌(V.aestuarianus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)4种致病性弧菌的主要外膜蛋白,通过SDS-PAGE分析比较4种弧菌主要外膜蛋白的组分。结果表明:4株弧菌的外膜蛋白电泳图谱一般可得到5～10条蛋白带,分子量多数集中在26~40 kD和48~85 kD。对所提取的4种弧菌主要外膜蛋白进行SDS-PAGE后,分别与自制的兔抗鳗弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清进行Western-blotting印迹分析。结果显示每种全菌抗血清可与相应菌的外膜蛋白部分组分发生免疫反应,并与其他3种弧菌外膜蛋白的部分组分产生交叉免疫反应,这些反应条带分子量主要集中于30~48 kD之间。本研究为进一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫学特性提供参考。     

饲料添加多维对花鲈生长、非特异性免疫指标及消化酶活性的影响

本试验旨在研究饲料中不同水平的多维含量对花鲈（Lateolabrax japonicus）生长性能、非特异性免疫指标及消化酶活性的影响。以初始体质量为（38.54±0.05） g的花鲈为试验对象，随机分为6组（每组3个重复，每个重复30尾鱼），基础饲料中分别添加不同水平（0.5%、1%、2%、3%、4%、5%）的多维，在室内循环养殖系统中饲喂28 d。结果表明:多维添加量对花鲈的体成分、存活率、肝指数、饲料系数和肥满度均没有显著影响（P>0.05）；当多维添加量为2%时，花鲈的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）均最大，与多维添加量为2%相比较，随着多维添加量继续增多，花鲈的WGR和SGR显著降低（P<0.05）；当多维添加量为5%时，花鲈的肠蛋白酶活性较0.5%和1%添加量组显著提高（P<0.05），而多维添加量为0.5%时，花鲈的肠淀粉酶活性显著高于其余任意一组（P<0.05），各组之间肠脂肪酶活性无显著差异（P>0.05）；与多维添加量为0.5%相比，多维添加量为5%时，能够显著提高花鲈血清中超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶活性以及血清中总蛋白含量（P<0.05），而血清溶菌酶活性没有显著变化（P>0.05）。结果表明:饲料中添加多维含量为5%时，能够明显提高花鲈的非特异性免疫指标及肠道蛋白酶活性，而在含量为2%时，能够明显提高花鲈的生长性能。     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

氯霉素单克隆抗体的研制及其特性分析

为了研制氯霉素单克隆抗体,建立氯霉素的简便有效的检测方法.采用碳二亚胺(EDC)方法制备氯霉素免疫抗原和包被抗原,经SDS-PAGE凝胶电泳,三硝基苯磺酸(TNBS)法鉴定表明偶联成功.采用制备的抗原CAP-HS-BSA((CAP-HS,氯霉素琥珀酸酯;BSA,牛血清白蛋白)免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株抗氯霉素的杂交瘤细胞株,细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定.经体内诱生法产生腹水,ELISA检测纯化腹水的效价为1:10~6.抗体的亲和常数分别为:1.13×10~(10) L/mol,1.41×10~(10) L/mol.ELISA检测显示这2株单克隆抗体与氯霉素琥珀酸交叉反应率为300%,与其他抗生素及结构类似物的交叉反应小,表明该单抗可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求.     

S7核糖体蛋白基因片段序列变异与花鲈属鱼类系统发育研究

对中国和日本海域花鲈属的3个种:花鲈(Lateolabrax maculatus)、鲈鱼(L. japoni-cus)和高体鲈(L. latus)的S7核糖体蛋白基因片段序列进行了扩增和序列测定,分析比较了3个种23个个体间的序列差异。在456bp的S7核糖体蛋白基因片段中,3个高体鲈个体中出现了3种单倍型,种内个体间有2个碱基差异;7个花鲈个体中出现了7种单倍型,种内个体间有21个碱基差异;13个鲈鱼个体中出现了12种单倍型,种内个体间有22个碱基差异。结果表明,花鲈属S7核糖体蛋白基因片段序列具有丰富的遗传信息,在亲缘关系较近的物种间也存在显著的序列差异,基于S7核糖体蛋白基因片段序列的NJ和ME系统树经1000次重复抽样检验后得到相似结果,表明S7基因内含子2是适合于研究分子系统发育的分子标记。利用Modeltest选取最佳核苷酸替代模型构建的NJ树表明:花鲈属鱼类由高体鲈分化,花鲈与鲈鱼的亲缘关系很近,而与高体鲈的亲缘关系较远。     

海水网箱养殖鲈鱼淋巴囊肿病的初步研究

在 1996年调查的基础上 ,首次报道了浙江海水网箱养殖鲈鱼淋巴囊肿病的发病情况 :发病季节在 6～ 8月 ,1龄鱼苗发病率 70 %,死亡率 30 %。电镜观察表明 ,体表和鳍上的疣状物主要由淋巴囊肿细胞组成 ,细胞内充满虹彩病毒颗粒。肝细胞和肠上皮细胞内没有发现病毒颗粒 ,但溶酶体数量增多 ,肝细胞结构有部分损伤。本文还描述了虹彩病毒在肥大细胞内的增殖过程。     

Unique monooxygenation pattern indicates novel flavin-containing monooxygenase in liver of rainbow trout

Vertebrate flavin-containing monooxygenases (FMOs) have only been isolated from mammalian organisms. However, many FMO substrates include pesticides which may adversely affect fish and other aquatic organisms residing in adjacent waterways to treated fields. Although FMO activities have been identified in fish, the exact isoform profile is uncertain. Utilizing prochiral methyl tolyl sulfides (MTS) and isoform-selective antibodies, an attempt was made to identify specific FMO isoforms which may be involved in sulfoxidation reactions which have been shown to bioactivate thioether pesticides, such as aldicarb. Rainbow trout hepatic microsomes treated with detergent to eliminate cytochrome P450 contributions catalyzed the formation of the sulfoxide of MTS in 75% S enantiomeric excess. These catalytic results contrast activities of the five other FMO isoforms including FMO1 (> 98% R) and FMO3 (50% R). Benzydamine N-oxidation was also observed as were methimazole, thiourea, and aldicarb sulfoxidation reactions. Antibodies to FMO1 recognized a single protein of 60 kDa in trout liver microsomes, while anti-FMO3 antibodies only slightly reacted with a 55-kDa microsomal protein. These results indicate a novel isoform profile in rainbow trout liver implicating either a mixture of competing FMO isoforms or a FMO1-like isoform displaying unique catalytic activity.     

鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究

对患溶藻弧菌病的鲈鱼进行了血液生理生化指标检测.结果表明,与健康鲈鱼相比,病鱼的红细胞、白细胞、血红蛋白、甘油三脂、钠、氯含量减少,而血沉、脆性、肌酐、钾、磷含量及血清碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶活性增加.由此说明溶藻弧菌对鲈鱼具有极强的致病性,它能引起鲈鱼体内各主要组织器官发生严重而广泛的病变.     

饲料中主要能量物质对大菱鲆幼鱼生长的影响

于1999年6－8月，采用正交设计统计方法，对主要能量物质蛋白质、脂肪和糖类对大菱Ping幼鱼生长的影响进行研究。利用L16（4^3）正交设计了16组大菱Ping幼鱼饲料，在各级饲料中，蛋白质、脂肪和糖类的含量范围分别为36％－45％、8％－20％和0％－6％，共进行了60d的喂养实验，并对饲料及鱼体成分进行分析测定。结果表明，各主要能量物质对鱼体增重和配合饲料转化率的影响顺序为蛋白质＞糖类＞脂肪，且蛋白质的变化对增重率的影响极显著，对饲料转化率的影响显著。     

Potassium channel in peripheral blood lymphocytes of turbot (Scophthalmus maximus)

In order to provide pertinent evidence of ion channel with immune response in the fish,whole cell patch-clamp technique was employed for potassium ion channel study in turbot(Scophthalmus maximus) . Lymphocytes were isolated by Percoll density gradient centrifugation from peripheral blood samples,and electrophysiological characters of the channel were analyzed. In the recorded cells,activated voltage of the channels was-42.5 ± 3.7 mV and the average peak current was 313.12 ± 28.2 pA. The channel was identified as voltage dependent,the current was outward and it could be inhibited by 10 mmol/dm 3 TEA or 5 mmol/dm 3 4-AP,a specific potassium channel inhibitor,identifying the existence of potassium channel in peripheral lymphocytes of the turbot.     

2002年山东省水产养殖病害测报分析

本文根据2002年山东省水产养殖病害测报数据，对草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼、大菱鲆、对虾、扇贝、海带等14个主要养殖品种病害发生情况进行了分析，并预测了2003年水产养殖病害发生趋势，提出了水产养殖动物病害的防治对策。