雄性半滑舌鳎GH基因多态性与激素水平及生长性状相关性分析

以雄性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究材料,分析了其GH基因外显子区域的多态性,同时分析了各基因型与其体重、体长、激素水平等的关联性。PCR-SSCP和测序结果表明,外显子4有1个突变位点382bp(c.T382C)为非同义突变(p.Phe106Leu)。单因素方差分析显示,382bp位点与体重、去内脏重和血浆T3水平显著相关(P0.05)。通过多重比较,CC基因型体重和去内脏重((234.58±8.11)g和(210.23±7.55)g)显著高于TT基因型((201.64±13.04)g和(180.21±12.13)g);CC基因型(3.01±0.07)ng·mL-1的T3水平极显著高于TT基因型(2.12±0.12)ng·mL-1。结果表明,半滑舌鳎中GH基因的突变可以影响其激素水平和生长性状,382bp位点可以用作分子标记,从遗传学角度辅助半滑舌鳎优良品种的分子选育。     

半滑舌鳎稚鱼脂肪分解关键酶基因的克隆及饲料中脂肪水平对其表达的调控

克隆了半滑舌鳎脂肪分解关键酶基因即激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)cDNA部分序列,并探讨了饲料中脂肪水平对半滑舌鳎稚鱼HSL及ATGL基因表达的影响。克隆所得到的HSL和ATGL片段长度分别为589bp和581bp,序列和系统进化分析表明半滑舌鳎的HSL和ATGL与大部分鱼类具有较高的同源性。采用不同水平的鱼油配制成5种不同脂肪水平(6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物质)的等氮饲料,饲养35日龄半滑舌鳎稚鱼30d,养殖过程中每天饱食投喂5次,养殖实验结束后采用实时荧光定量PCR分别测定各处理稚鱼内脏团的HSL及ATGL mRNA相对表达量。结果表明,高脂饲料组(21.88%)显著促进了半滑舌鳎稚鱼内脏团HSL基因的表达(P0.05),但饲料脂肪水平对于半滑舌鳎稚鱼内脏团的ATGL表达量未产生显著影响(P0.05)。     

半滑舌鳎IGF1基因编码区的多态性与生长性状及表达的相关性分析

胰岛素样生长因子1(IGF1)在鱼类生长内分泌调节过程中发挥着重要的调控作用。本研究检测了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)IGF1基因外显子的单核苷酸多态性(SNPs),分析其基因型与生长性状、血液生化指标的关系及基因表达的相关性。结果显示,IGF1基因外显子5的884bp处一个位点发生突变,此突变处碱基C变为A,即C884A,此突变发生于终止密码子之后,并且发生在WD40结构域,可能会对基因的转录、表达和生长性状产生影响。此位点与体重(P0.05)、去内脏重(P0.05)呈显著相关性,AA基因型的体重和去内脏重显著高于AB基因型(P0.05),AA基因型的尿素含量显著大于AB基因型(P0.05),AA基因型的mRNA表达量也显著高于AB基因型(P0.05)。研究表明,IGF1基因编码区的多态性对半滑舌鳎的生长性状、血液生化指标和基因表达有显著影响,IGF1基因可以作为选择育种的一种分子标记,从遗传学的角度辅助半滑舌鳎优良品种的分子选育。     

半滑舌鳎des基因的表达及其启动子功能分析

利用NCBI上已经发表的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组及转录组序列,发现了半滑舌鳎两个有结蛋白(Desmin)基因(des和des-like),且des-like具有两个剪切型des-like_X1、des-like_X2。系统进化树及基因结构分析发现,半滑舌鳎的des基因和des-like基因分别与硬骨鱼的des基因和des-like基因聚为一支,物种间des和des-like氨基酸序列相似性分别在90%和85%以上。保守性与染色体共线性分析发现,半滑舌鳎的des基因和哺乳动物的des基因具有相同的起源,而其des-like基因是通过硬骨鱼的第三次全基因组复制获得的。qRT-PCR的检测分析发现,des基因在肠和心脏中表达量较高,在肌肉中只是痕量表达;而des-like基因则在心脏和肌肉中表达最高,在肠中痕量表达,说明des与des-like已经出现了功能的分化而且可能存在功能上的互补效应。有趣的是,des-like_X1只在心脏中表达,本研究推测des-like_X1对于半滑舌鳎的心脏发育具有重要作用。des基因呈现母源性表达,而des-like在胚胎发育早期表达量较低,从神经胚后表达量开始升高,此时是肌节与心脏发育的时期,说明des-like可能参与胚胎发育时期的肌节与心肌发育。此外,通过PCR克隆了半滑舌鳎结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行启动活性分析。结果表明,半滑舌鳎des基因ATG上游长度为667 bp的片段是其核心启动子,为进一步研究des基因的功能奠定了基础。     

人工养殖半滑舌鳎卵巢发育及其产卵类型研究

研究了人工养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢发育组织学的季节变化及其与性成熟系数(gonadosomatic index,简称GSI)和肝质量指数(hepatosomatic index,简称HSI)的关系。结果表明,半滑舌鳎成熟鱼卵巢发育经历Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期,再到重复发育Ⅱ期;人工养殖条件下,3~5月份大部分鱼卵巢处于Ⅱ期,从6月份开始,其卵母细胞内开始沉积卵黄颗粒,9~11月份,卵母细胞内卵黄颗粒充盈整个胞质,基本达到生长成熟,排卵后至翌年2月份,卵巢进入了退化吸收Ⅵ期或重复发育Ⅱ期;繁殖期GSI达到最高峰;产卵后或重复发育Ⅱ期,GSI显著下降,此时HSI显著升高至全年最高峰;半滑舌鳎在1 a中只有1个繁殖期,进行分批产卵。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)群体遗传结构的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对半滑舌鳎野生和养殖4个群体的遗传结构进行了比较研究.结果表明,半滑舌鳎养殖群体遗传变异水平低于野生群体,两个野生群体的多态位点百分数、观察杂合度、期望杂合度、平均有效等位基因数的平均值(分别为21.275%、0.1177、0.0854和1.1499)分别高于两个养殖群体的平均值(分别为18....     

赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)MHC ⅡB基因的克隆与表达多态性分析

主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物体内重要的非特异性免疫基因之一。为了研究赤点石斑鱼的MHC基因的结构与表达特性,本研究运用RACE,Realtime PCR及SSCP等技术,首次成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC ⅡB基因的4个cDNA全序列,序列全长为1 195~1 355 bp,含有3'UTR、启动子、多肽结合区(β1)I、GC区(β2)、跨膜区、胞质区和5'UTR区,编码区大小为750 bp。氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHC ⅡB分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区存在极其丰富的变异,β1区由1个α螺旋与4个反向平行的β折叠构成多肽结合区,β2区由多个β折叠构成2个反向平行的三明治结构。利用SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC ⅡB的表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,表达多态性也异常丰富。此外,根据MHCIIB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记。     

半滑舌鳎的一种细胞凋亡抑制因子的克隆、鉴定与分析

克隆半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的1种细胞凋亡抑制因子survivin基因,并对其序列及表达模式进行分析.结果表明,该基因cDNA 序列全长704 bp(GenBank登录号为EU499314),包括86 bp5'非翻译区,444 bp开放阅读框以及含 poly(A)信号的174 bp的3'非翻译区,编码147个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎survivin氨基酸序列与斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人survivin氨基酸序列的同源性分别达到了63.3%,49.0%,43.7%,43.6%和41.5%.RT-PCR分析表明,survivin基因在半滑舌鳎成体雌鱼卵巢中大量表达,在雌鱼的肾脏中微量表达,在其它雌鱼的组织中无表达,在雄性的任何组织中均无表达.该基因在受精卵、多细胞和囊胚3个胚胎发育的早期阶段,大量表达,而随着胚胎发育的进程,survivin基因的表达逐渐减少,在孵化前尾芽期胚胎中只有微量表达,在孵化后5 d的仔鱼中,几乎检测不到survivin基因的表达.表明该基因可能参与卵子形成和胚胎的早期发育.     

适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

本实验旨在探究维生素E对半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因表达的影响。作者在每千克等氮等能的基础饲料中分别添加0、400和1 600mg的DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)投喂半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼(464±2.6) g,进行为期8周的养殖实验;另外,在L-15培养基中添加0、18和54μmol/L的维生素E,对半滑舌鳎成鱼(464±2.6) g的垂体细胞进行为期3 d的体外原代培养实验。分别取垂体组织和原代细胞,通过荧光实时定量PCR分析其gh mRNA的相对表达量。实验结果表明:垂体组织中gh mRNA的相对表达量随着饲料中维生素E含量的增加而呈现先升高后下降的变化趋势,在400 mg/kg组时显著高于其他各组(P0.05);随着细胞培养液中维生素E浓度的升高, gh mRNA的相对表达量显著增加(P0.05)。由此可见,适宜浓度的维生素E能够促进半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因的表达。     

大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用

用8个微卫星标记组合建立了2个微卫星多重PCR体系,对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱认证、亲子鉴定和遗传多样性研究。2个多重PCR体系中8个微卫星位点共检测到等位基因49个,每个位点等位基因数为3~8个。根据已知亲本及子代基因型,成功推断出了3个缺失亲本的基因型。在双亲未知的情况下2个多重PCR的8个微卫星位点累积排除概率是96.58%,已知1个亲本时累积排除率为99.71%,亲子鉴定准确率为96.42%。采用70个个体进行双盲验证,利用UPGMA法对7个家系的70个体进行了聚类分析,同一家系95.71%的个体聚类分析结果与系谱来源一致。Cervus 2.0软件亲子鉴定结果表明亲子鉴定准确率为92.86%。2个多重PCR体系的建立为大菱鲆不同家系混养后的亲子鉴定、系谱分析和分子辅助家系管理提供了技术手段。     

Genetic variability of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis populations using microsatellite markers

Ten highly variable microsatellite loci were performed in order to evaluate the genetic variability of wild and hatchery samples of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis. A group of 200 genotypes belonging to four wild samples, Laizhou (LZ), Weihai (WH), Qingdao (QD), Rizhao (RZ) and one hatchery sample, Mingbo (MB), were screened. All of the ten microsatellite loci screened in this study showed marked polymorphism. A total of 70 different alleles were observed over all loci. The number of alleles per locus ranged from 4.2 to 10.6. The average of expected and observed heterozygosity ranged from 0.67 to 0.82, and from 0.77 to 0.87, respectively. A total of 10, 16, 10, 11 and 5 unique alleles each were found in LZ, WH, QD, RZ and MB populations. The effective number of alleles varied from 2.87 for HSTS_7 to 6.83 for HSTS-h. The number of average genotypes ranged from 6.0 for HSTS_a to 15.4 for HSTS_h. As compared with the wild populations, the hatchery population, MB, showed significant genetic changes such as fewer alleles per locus (P <0.05), a smaller number of low frequency alleles (P <0.05), a small number of unique alleles and a small number of genotypes (P <0.05), all indicative of a reduction in genetic diversity.     

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)EST-SSR标记开发及通用性检测

利用已发表的EST序列设计引物并结合PCR筛选的方法,对许氏平鲉多态EST-SSR引物进行了开发。结果表明:(1)许氏平鲉EST-SSR位点发现率为9.14%,核心序列以二碱基重复出现频率最高,占到33.03%,其中以TG/CA基序最为丰富。(2)共设计引物56对,46对实现有效扩增,其中18对具有多态性。(3)野生群体遗传多样性分析显示,每个位点观测等位基因数(Na)为2—9,平均观测等位基因数为3.89;观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及平均值分别是0.0333—0.8000、0.0333—0.7927和0.3037、0.3757;每个位点的多态信息含量(PIC)在0.0323—0.7522之间,其中高度多态位点5个,中度多态位点5个;经Bonferroni校正后,3个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡,但两两位点间不存在连锁不平衡现象。(4)许氏平鲉多态EST-SSR引物对朝鲜平鲉、褐菖鲉通用性检测结果表明,引物对二者的通用率和多态率分别为88.89%、100.00%和33.33%、88.89%。研究表明,这些通用引物可用于相关物种的遗传多样性评价、系统进化分析和比较基因组作图等研究。     

半滑舌鳎雌性特异fosmid克隆的筛选及FISH定位

通过对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行有序混合,成功构建了两步-三维PCR筛选体系,为后续的基因筛选奠定了基础。通过对半滑舌鳎W染色体文库序列进行引物设计,并分别在雌、雄鱼基因组DNA中筛选,获得1对雌鱼特异性引物。使用该引物对fosmid文库进行筛选,得到1个雌鱼特异性克隆,并通过荧光原位杂交技术将克隆定位到了W性染色体上,证实了使用该体系进行文库筛选的有效性以及雌鱼引物的特异性,建立了半滑舌鳎遗传性别的分子及细胞遗传学鉴定方法,为后续半滑舌鳎基因组及性染色体的研究奠定了基础。     

Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in large yellow croaker, Larimichthys crocea

An (AC)n-microsatellite-enriched library for Larimichthys crocea was constructed in this study. Primers for fifty simple sequence repeat (SSR) loci were synthesized and genotyped on 30 L. crocea individuals from Guanjingyang wild population (WP) in Fujian Province and 38 individuals from Ningbo cultured population (CP) in Zhejiang Province. Only 21 loci were successfully amplified and polymorphic in two populations. In WP, the observed heterozygosity (H_O ) ranged from 0.233 to 0.900 and the expected heterozygosity (H_E ) ranged from 0.326 to 0.893, with an average of 7.8 alleles/locus, the polymorphism information content (PIC) ranged from 0.283 to 0.866 (mean 0.731). In CP, the H O ranged from 0.189 to 0.892 and the H E ranged from 0.333 to 0.800, with an average of 4.4 alleles/locus. The probability test showed significant departures from HWE in 9 and 2 of the 21 loci in WP and in CP, respectively. Deficiency of heterozygotes at four loci showed the presence of null alleles (P <0.01). The PIC of 20 microsatellite loci in WP were greater than 0.50. Overall, these novel markers are potentially useful for the study of population genetics, construction of genetic linkage and quantitative trait loci maps in large yellow croaker.     

日本蟳(Charybdis japonica)微卫星位点的分离及遗传多样性分析

采用磁珠富集法,以生物素标记的(cA)12寡核苷酸为探针,构建了日本蟳基因组微卫星富集文库.通过PCR法从文库中共筛选出89个微卫星位点,其中完全型(perfect)共75个,占84.27%;不完全型(imperfect)12个,占13.48%;复合型(compound)2个,占2.25%.根据微卫星位点的侧翼序列,设...     

24个泥蚶EST-SSR标记的开发与分析

利用3000条泥蚶(Tegillarca granosa)单拷贝序列,筛选到132条含有SSR候选位点序列,成功设计引物50条。群体多态性检测结果显示,24个SSR位点为多态性,各位点的等位基因介于2~5个,平均等位基因数3.5个;观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000~0.591、0.045~0.727、0.043~0.696;多态位点中有11个高度多态、4个中度多态、9个低度多态;进行哈迪-温伯格平衡检测后,用Bonferroni correction法进行校正,结果有17个位点显著偏离平衡。     

缢蛏(Sinonovacula constricta)EST-SSR 分布特征及引物开发利用

采用CAP3软件对NCBI上的5296条缢蛏ESTs序列进行了微卫星特征分析。结果表明,经拼接、去冗得到非冗余EST序列3453条,含SSR位点的EST序列267条,共307个SSR位点,检出率为8.89%,平均每6.83kb出现1个SSR位点。设计了40对EST-SSR引物并进行PCR扩增,29对引物能扩增出理想的PCR产物,其中多态性引物14对。利用14对多态性引物分析了乐清湾缢蛏遗传多样性,共检测到等位基因数(Na)61个,每个位点的等位基因数为2—12个。二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占15.96%、37.13%和35.50%。乐清湾缢蛏群体观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别为0.569、0.490和0.449,表明乐清湾缢蛏遗传多样性较丰富。     

缢蛏(Sinonovacula constricta)EST-SSR标记与生长性状的相关性分析

利用16个微卫星标记对缢蛏F1家系的遗传多样性和标记-性状相关性进行了研究。结果显示,16个SSR位点共检测到39个等位基因,平均等位基因数(Na)和平均有效等位基因数(Ne)分别为2.44和2.09;多态信息含量(PIC)为0.40;平均观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)分别为0.58和0.63,部分位点基因型分布严重偏离孟德尔定律,暗示其可能与适应性基因相连锁,其中YC-8位点附近可能存在杂合不利存活基因。位点YC-96和YC-123与体重呈显著相关(P0.05),YC-96的BC基因型和YC-123的BB基因型均为体重性状的优势基因型,其对应的壳长、壳宽、壳高和体重4个生长性状表型值都最大,可以作为选育快长性状的候选分子标记;YC-1位点与壳宽呈显著相关(P0.05),其中BB型是壳宽的优势基因型;YC-93位点与壳宽、壳高呈极显著相关(P0.01),其中AB型是壳高的优势基因型,BB和BC型是壳宽的优势基因型。对YC-1、YC-93、YC-96和YC-123进行以体重性状为参照的不同基因型组合比较,找到了最优组合(BB/BB(BC)/BC/BB),与4个位点单独分析对应的最优基因型基本完全一致,符合加性作用模型。筛选出的与生长性状相关的标记可为标记辅助选择育种(MAS)提供参考依据。     

中国鲎(Tachypleus tridentatus)微卫星标记筛选及种群遗传多样性和遗传结构分析

采用FIASCO方法构建了中国鲎(Tachypleus tridentatus)(CA)_n微卫星富集文库,对214个阳性克隆进行测序,筛选获得60条含有微卫星的序列,其中可设计引物的序列共38条。38对微卫星引物在37个中国鲎个体中PCR检测发现,只有9个位点具有多态性,其等位基因数为5—14个,每个位点平均具有8.1个等位基因。9个位点之间不存在连锁。利用该9个具有多态性微卫星标记分析了中国沿海9个中国鲎地理群体的种群遗传多样性和遗传结构。结果表明:中国沿海的中国鲎种群遗传多态性水平仍较高, 9个地方群体间无遗传差异,它们之间未见显著分化,且有着较高的基因流;推测人为的迁移是造成遗传无分化的主要原因。我们建议中国鲎已绝迹的海域可从其他海域引入中国鲎个体来恢复地方群体资源。     

许氏平鲉4 个野生群体遗传多样性微卫星分析

利用18对微卫星引物分析了荣成湾群体1、荣成湾群体2、即墨群体和龙口群体共4个许氏平鲉(Sebastes schlegeli)野生群体的遗传多样性。结果表明:4个群体的平均有效等位基因数分别为3.1、2.7、2.8和2.7,平均期望杂合度分别为0.590、0.540、0.552和0.491,平均多态信息含量分别为0.577、0.495、0.538和0.528。4个许氏平鲉群体均表现出较高的遗传多样性水平,但也都存在杂合子缺失现象。Χ2检验显示,4个群体中大部分微卫星位点偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。群体间Fst值为0.04,说明遗传变异主要存在于群体内,群体间的遗传分化程度较低。该研究结果将为许氏平鲉种质资源保护和合理利用以及人工增殖提供理论参考。