波吉卵囊藻胞外滤液对铜绿微囊藻转录水平的影响

【目的】探索波吉卵囊藻胞外滤液对铜绿微囊藻的抑制机理。【方法】采用Illumina平台,对使用BG11培养基(对照组)和波吉卵囊藻胞外滤液(实验组)培养的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行通路富集分析,并对部分差异表达基因进行qRT-PCR验证。【结果】与对照组相比,波吉卵囊藻胞外滤液处理后的铜绿微囊藻组中筛选1483个表达差异显著的基因,其中上调表达基因788个,下调表达基因695个。GO功能分析将差异基因划分为35个子类别,包括催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、膜、膜部分等。KEGG通路分析中,所有差异基因聚集在108个通路,其中84个差异基因注释在代谢功能类别中,而氧化磷酸化通路富集最显著。氧化磷酸化通路中,相关基因表达以上调为主(26个DEGs,20个上调,6个下调)。qRT-PCR验证结果与转录组测序结果的表达变化趋势一致。【结论】波吉卵囊藻滤液引起铜绿微囊藻氧化磷酸化途径上基因表达上调,ATP合成效率提高。     

金钱鱼cyp17a1基因克隆、组织分布及在卵巢发育中的表达

【目的】克隆金钱鱼cyp17a1基因,分析其在组织中的分布、卵巢不同发育时期中的表达变化,为金钱鱼繁殖生物学提供理论依据。【方法】通过金钱鱼转录组文库筛选和RT-PCR进行cyp17a1 c DNA序列扩增;用DNAstar软件比较Cyp17a1同源性,MEGA5.0构建系统进化树,RT-PCR检测cyp17a1组织表达,实时定量PCR检测不同卵巢发育时期cyp17a1的表达量。【结果】金钱鱼cyp17a1开放阅读框编码515个氨基酸残基;Cyp17a1氨基酸序列与同属鲈形目鱼类Cyp17a1同源性较高(87.8%～92.7%),与大黄鱼最高(92.7%),与其他目鱼类同源性次之(72.7%～85.0%),与硬骨鱼类Cyp17a2或Cyp17a1-like同源性最低(48.2%～51.7%);所有硬骨鱼类Cyp17a1聚为一支,在Cyp17a1分支中,金钱鱼与鲈形目鱼类聚为一支;cyp17a1在性腺中表达量较高,在精巢中表达最强;在肝、脑和头肾表达较弱;在脾脏、肠、心脏、肌肉和鳃中未检测到表达;卵巢中cyp17a1的表达量随卵巢发育逐渐增加,Ⅳ期卵巢中cyp17a1表达量最高。【结论】cyp17a1在性腺中表达量较高,在金钱鱼卵巢发育过程中有重要作用。     

马氏珠母贝金黄壳色选育群体植核后差异表达免疫基因筛选

【目的】筛选(Pinctadamartensii)金黄壳色选育群体植核后免疫相关基因与代谢通路。【方法】利用转录组对植核前后马氏珠母贝的血细胞进行转录组建库及测序分析。【结果和结论】分别获得61.78×106和62.68×106个高质量转录组数据,且映射到参考基因组的平均映射率分别为70.16%和67.82%。与植核前相比,植核后分别有2 925个和3 097个基因显著上调和下调(差异倍数≥2,校正后P≤0.001),其中包括免疫相关基因凝集素、Toll样受体,热休克蛋白等。对差异基因进行GO分类分析,分为基因的分子功能、细胞组分、生物过程3个大类,并细分为11个子类别,其中结合和催化功能的基因较多。KEGG分类分析差异基因,可将基因参与的KEGG代谢通路分为6个分支,细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病(仅限动物)、代谢、有机系统。KEGG富集结果显示,差异表达基因显著富集到免疫相关通路胞质DNA感应途径、白细胞跨内皮迁移等免疫通路。     

ERR-dsRNA对罗氏沼虾卵巢中ERR及生殖相关基因表达的影响

【目的】研究雌激素相关受体(Estrogen-related receptor,ERR)在雌性罗氏沼虾生殖过程中的功能。【方法】通过注射双链RNA(Double-strandedRNA,dsRNA)干扰罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)ERR的表达,对干扰组和对照组的卵巢样本进行转录组测序,筛选与生殖相关的差异表达基因,并通过qPCR检测它们在卵巢发育过程中的表达。【结果】注射ERR-dsRNA后,卵巢中ERR mRNA和ERR蛋白的表达显著下降。ERR-dsRNA干扰组和对照组卵巢转录组测序获得的差异表达Unigene中,9条被富集到生殖GO条目,3条被富集到生殖过程GO条目,21条被富集到卵母细胞减数分裂Pathway条目。这些生殖相关的Unigene中差异倍数较大的有9条,经qPCR验证,5条在ERR干扰组和对照组间的表达差异有统计学意义。这5条Unigene中有3条在卵巢发育过程中的表达差异有统计学意义,其中2条(CL7112.Contig4_All和Unigene4600_All)与卵母细胞减数分裂有关,1条(CL4888.Contig2_All)与生殖相关激素的合成及释放有关。【结论】ERR可通过调控卵母细胞减数分裂和生殖相关激素的合成与释放调控罗氏沼虾卵巢发育。     

金钱鱼Zar1基因克隆及其表达分析

【目的】分析金钱鱼(Scatophagus argus)卵巢发育过程重要基因——合子阻滞因子1(Zygote arrest 1,Zar1)组织表达及其在卵子成熟和胚胎发育过程中的表达。【方法】克隆金钱鱼Zar1基因,采用反转录-PCR(RT-PCR)检测其在各组织的分布情况,实时荧光定量PCR(q PCR)研究Zar1在不同卵巢发育时期和胚胎发育过程中的表达。【结果】金钱鱼Zar1的开放阅读框(ORF)序列全长为1008bp,编码335个氨基酸。序列分析发现,金钱鱼Zar1在蛋白C末端高度保守,具有非典型的PHD基序(Plant homeo domain)和锌指结构域。金钱鱼Zar1同源性分析发现,它与鲈形目物种相似度最高,其中大黄鱼(Larimichthys crocea)相似性最高,为85.1%。系统进化树分析显示,金钱鱼Zar1与大黄鱼亲缘关系最近,与其分类地位一致。组织分布发现,金钱鱼Zar1仅在卵巢中表达。Zar1在II、III和IV期卵巢表达呈现逐渐递增趋势,其中IV期表达水平显著高于II期卵巢。Zar1在胚胎发育早期表达较高,后期较低,其中在四细胞期表达水平最高,之后逐渐降低。【结论】金钱鱼Zar1在卵巢和胚胎期表达,在金钱鱼卵子发生和胚胎发育阶段发挥重要作用。     

DNA甲基化修饰对金钱鱼卵巢Cyp17a1表达水平的影响

【目的】分析DNA甲基化修饰对金钱鱼（Scatophagus argus）卵巢Cyp17a1表达的影响,进一步认识卵巢发育成熟相关基因表达的调控机制。【方法】分别取卵巢发育III、IV期的金钱鱼,以及投喂添加0（对照）、50、100μg/g雌二醇饲料30 d的2龄雌鱼,用MethPrimer软件分析其Cyp17a1基因CpG二核苷酸位点分布特征,并预测CpG岛;采用亚硫酸氢盐测序法检测不同发育时期卵巢以及投喂雌二醇个体卵巢中的Cyp17a1的DNA甲基化修饰水平,并用实时荧光定量PCR分析Cyp17a1基因表达水平。【结果】金钱鱼Cyp17a1翻译起始位点2 000 bp后无CpG岛,取第1外显子含有5个CpG位点（翻译起始位点后106、116、129、148和203 bp处）的区域用于DNA甲基化水平检测。金钱鱼III期卵巢Cyp17a1外显子1的DNA甲基化修饰水平显著高于IV期卵巢（P <0.05）,与其mRNA表达水平呈负相关。116、129和203 bp处DNA甲基化存在发育时期差异,但106和148 bp处差异不显著（P> 0.05）。投喂雌二醇后,金钱鱼卵巢C...     

金钱鱼IGF-1和IGF-2的克隆及其在胚胎发育过程的表达

【目的】克隆金钱鱼IGF-1和IGF-2基因,研究二基因在金钱鱼胚胎发育过程中的表达。【方法】采用实时荧光定量PCR,以不同发育时间点的金钱鱼(Scatophagus argus)胚胎为实验材料,分析IGF-1和IGF-2基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式。【结果】金钱鱼IGF-1和IGF-2的蛋白全序列分别为186和215个氨基酸。序列分析表明,IGF-1和IGF-2均有胰岛素样生长因子蛋白典型结构,含有N端信号肽、B、C、A、D和E结构域,且有6个保守的半胱氨酸,与其他鲈形目鱼类花鲈的IGF-1和IGF-2相似性较高(95%和91%)。IGF-1从受精卵到出膜的胚胎发育过程中表达量逐渐上调;IGF-2在受精后至囊胚期表达量极低,而在原肠胚期和神经胚期表达量显著上调至最高水平,在神经胚期后表达量显著降低并维持稳定。【结论】IGF-1和IGF-2序列保守性低,与鲈形目同源性高,在金钱鱼胚胎发育过程中起不同调控作用。     

三氯生对雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因表达的影响

【目的】研究三氯生(TCS)对雌性硬骨鱼类肝胰脏损伤的相关分子机制。【方法】采用半静态水体接触染毒法,将雌性斑马鱼(Danio rerio)暴露于0、0.017、0.034、0.068 mg/L的TCS溶液42 d,采用普通PCR和实时荧光定量PCR技术测定雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因(Bcl-2、p53、MDM2、Bax)的表达情况。【结果】0.017~0.068 mg/L组的雌性斑马鱼肝胰脏Bcl-2、MDM2和Bax基因的表达极显著下调(P<0.01),p53基因的表达极显著上调(P<0.01)。【结论】0.017~0.068 mg/L的TCS显著影响雌性斑马鱼肝胰脏凋亡相关基因的表达,促进雌性斑马鱼肝胰脏细胞凋亡的发生。     

杂交石斑鱼和母本褐点石斑鱼转录组测序及差异表达基因分析

【目的】筛选褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)及其杂交子一代(E. fuscoguttatus♀×E. polyphekadion♂,F1)的差异表达基因,探讨褐点石斑鱼及F1代之间的生长差异性。【方法】采用Illumina HiSeq 2000测序平台对同龄的褐点石斑鱼及其杂交F1的脑、肝脏和肌肉组织进行转录组测序,通过edgeR软件包筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能注释和KOG注释,最后通过实时荧光定量PCR验证转录组数据。【结果】测序的原始数据经过质量控制和组装共得到54 610条unigenes。组装的unigenes共有28 832条unigenes得到注释,共获得20234条差异表达基因,其中有10218条上调,10016条下调。GO功能注释显示共34061条unigenes聚类到涉及生物过程、分子功能和细胞组分的53个功能类别,其中被较多基因聚类到的功能类别为细胞过程、结合、单一生物过程、代谢过程和催化活性等。KOG注释发现,42 753 unigenes被注释到25个功能类别中,其中较多涉及信号转导机制、基因功能预测、翻译后修饰,蛋白质周转和分子伴侣、转录等。进一步筛选到一批和生长相关的差异表达基因,如GH、GHRH、PRL、SLP、AVTp等,这些差异表达基因在F1中的表达水平均高于其亲本褐点石斑鱼,与杂交F1相较于褐点石斑鱼生长快速的性状相符。【结论】研究完成了对褐点石斑鱼及其杂交F1的转录组测序、组装,获得了测序数据在不同数据库的功能注释信息,同时筛选了一批生长相关差异表达基因,这些基因在F1中的表达水平均高于其亲本褐点石斑鱼,与现实生长性状相符。     

青鳉foxl2基因敲除突变体的构建与表型分析

【目的】建立青鳉(Oryziaslatipes)foxl2基因突变体材料,为阐释foxl2基因功能提供良好的动物模型和研究基础。【方法】利用CRISPR/Cas9技术敲除青鳉foxl2基因,建立突变体材料。观察foxl2基因突变体的第二性征、性腺等形态特征;组织学分析性腺结构与性腺中细胞类型;用定量PCR检测性腺发育相关基因的表达情况。【结果】通过CRISPR/Cas9技术成功敲除青鳉foxl2基因,建立foxl2基因缺失4个碱基的青鳉突变体。从第二性征与性腺表型上,foxl2-/-突变体均表现为生理雄性;组织切片分析发现,foxl2-/-突变体的性腺结构与野生型卵巢和野生型精巢均有显著差异,存在退化的核仁外周卵母细胞与精子,提示foxl2-/-的性腺在组织结构上类似精巢;定量PCR结果显示,foxl2-/-突变体中雄性性腺发育关键基因sox9b、gsdf、amh等的表达量升高,雌性性腺发育关键基因cyp19a1a等的表达量下降。【结论】通过CRISPR/Cas9技术成功建立青鳉foxl2基因缺失的突变体,foxl2-/-突变体有遗传雌性、生理雄性的表型特征,foxl2对维持青鳉性腺功能有重要作用。     

基于转录组测序的方斑东风螺单核苷酸多态性位点挖掘及功能注释

【目次】了解方斑东风螺中响应LPS刺激的SNP位点及SNP所在基因SNP-Unigenes的功能。【方法】使用SOAPsnp软件分析不同时间条件下转录组数据中的SNP位点,使用GO、COG和KEGG数据库进行功能注释。【结果】转录组数据中共挖掘到673 782个SNP位点,分布在110 869条SNP-unigenes序列上。SNP类型分析表明,转换位点发生的频率远高于颠换位点,且6种单碱基变异类型中以A/G转换发生概率最大。有5866条SNP-unigenes富集到298个KEGG子集中,其中以"内吞作用"子集中富集的SNP-Unigenes最多,共富集182条。     

盐度对波吉卵囊藻叶绿素荧光参数的影响及PsbA基因的克隆与表达分析

【目的】研究波吉卵囊藻(Oocystis borgei)在不同盐度下叶绿素荧光参数的变化和编码叶绿体D1蛋白的PsbA基因的表达特性。【方法】利用叶绿素荧光仪测定不同盐度条件下波吉卵囊藻叶绿素荧光参数;利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获取波吉卵囊藻PsbA基因序列,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PsbA基因在不同盐度下的表达情况。【结果】高盐(盐度60)条件下PSⅡ最大光化学量子产量(F_v/F_m)及PSII实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)显著下降(P 0.05)。克隆获得1 314 bp波吉卵囊藻PsbA基因cDNA序列,包含1 062 bp开放阅读框(ORF),预测编码353个氨基酸,该蛋白属于跨膜蛋白。qPCR结果表明,高盐(盐度60)条件下PsbA基因极显著下调(P 0.01)。【结论】高盐(盐度60)显著抑制波吉卵囊藻PsbA基因的表达和叶绿素荧光参数(F_v/F_m和ΦPSⅡ)的降低,表明波吉卵囊藻处于胁迫状态;而盐度10和30能促进PsbA基因的表达。     

稀杯盔形珊瑚转录组分析

以高通量测序技术Illumina Hi SeqTM2000对稀杯盔形珊瑚(Galaxea astreata)进行转录组测序分析,共获得50 360 620条短序列(reads)。利用Trinity软件对所有reads从头组装后得到81 014条单基因簇(Unigenes),60 471条(74.58%)编码蛋白框(Coding Sequences,CDs)。与Nr(Non-redundant,非冗余)、COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins,蛋白相邻类的聚簇)、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,京都基因与基因组百科全书)、Swissprot四大数据库比对共获得36 545条注释基因。其中与COG数据库比对获得14 491条注释基因,分为24个功能类别,其中参与一般功能预测类的Unigene数最多,有4 642条;KEGG分析比对获得16 021条注释基因,分成241类,包括代谢通路、钙离子信号通路、MAPK信号通路等,在所有通路中参与代谢途径的基因数最多,共有2 450条(15.29%);GO(Gene Ontology,基因本体)功能分类将Unigene分为47个类别。     

长春花铜锌超氧化物岐化酶基因克隆及其在黄龙病菌侵染后的表达

【目的】克隆长春花(Catharanthus roseus)铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase, Cu/Zn-SOD)基因,研究黄龙病菌("CandidatusLiberibacterasiaticus")侵染后长春花Cu/Zn-SOD基因(Cr Cu/Zn-SOD)的表达。【方法】根据不同作物Cu/Zn-SOD基因序列同源性筛选出CrCu/Zn-SOD基因引物,扩增得Cr Cu/Zn-SOD基因片段,用SMART-RACE方法扩增出Cr Cu/Zn-SOD基因的3′和5′末端,用q RT-PCR分析嫁接后不同时间长春花叶、主茎和根中Cr Cu/Zn-SOD基因的m RNA转录水平。【结果】拼接后获得Cr Cu/Zn-SOD基因全长796 bp(Genbank登录号KP864639),该基因与其他物种的Cu/Zn-SOD基因同源性达86%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域及N末端无信号肽。染病长春花叶、茎和根中,CrCu/Zn-SOD的表达在侵染25 d前均上调,30～45 d时表达量持续下降,45 d时叶、茎和根中表达量分别下调1.8倍、2.97倍和2.9倍。【结论】长春花Cu/Zn-SOD序列与其他物种同源性较高,Cr Cu/Zn-SOD表达受黄龙病菌侵染诱导,表达量变化与长春花抗黄龙病菌侵染能力密切相关。     

三氯化铁絮凝小球藻的采收工艺

【目的】研究三氯化铁对小球藻絮凝采收效果的影响,并优化采收工艺条件。【方法】分析FeCl₃浓度、小球藻初始浓度和絮凝时间对小球藻采收效率影响,利用响应面法优化利用FeCl₃采收小球藻的工艺参数。【结果】单因素实验表明,FeCl₃质量浓度为0.6 g/L、小球藻初始质量浓度为0.42 g/L和絮凝时间为30 min时,小球藻的采收效率最高。响应面法分析表明,小球藻初始浓度对小球藻采收率有显著影响(P<0.05);影响采收效率的主次因素顺序为小球藻初始浓度>FeCl₃浓度>絮凝时间;FeCl₃浓度和小球藻初始浓度的交互作用对小球藻的采收效率有显著影响(P<0.05);FeCl₃浓度二次项对小球藻的采收效率有极显著影响(P<0.01)。【结论】利用FeCl₃采收小球藻的最佳工艺条件:小球藻初始质量浓度为0.55 g/L,FeCl₃质量浓度为0.6 g/L,絮凝时间为38 min,此时的采收效率为(98.6±1.9)%。     

2月龄花鲈形态性状与体质量相关性及通径分析

【目的】探明花鲈(Lateolabrax maculatus)早期主要形态性状对体质量的影响程度,为其良种选育提供参考。【方法】采用数理统计方法对500尾2月龄花鲈的全长(X₁)、体长(X₂)、体高(X₃)、头长(X₄)、头高(X₅)、躯干长(X₆)、吻长(X₇)、眼径(X₈)、尾柄长(X₉)、尾柄高(X₁₀)等10个形态性状和体质量(Y)进行测量分析。【结果】相关性分析结果表明,10个形态性状与体质量的相关性均达到了极显著水平(P<0.01)。通径分析结果发现,体高、全长、眼径、躯干长、吻长、体长等6个性状是影响2月龄花鲈体质量的主要形态性状,其中仅体高对体质量的直接作用大于间接作用,为影响体质量的核心变量。决定系数显示,体高对体质量的单独决定系数最大(0.324),全长和体高对体质量的共同决定系数最大(0.287),6个形态性状对体质量的总决定系数为0.947,表明本研究已将影响2月龄花鲈体质量的主要形态性状全部纳入。经逐步回归分析,拟合得到最优线性回归方程为Y=-1.468+1.314X₃+0.160X₁-0.307X₈+0.149X₆+0.305X₇+0.046X₂。【结论】除体质量外,还须将体高作为花鲈早期选育的目标性状。     

鱼干曲霉菌分离株鉴定及产毒特性

【目的】探明湛江市售鱼干中曲霉菌(Aspergillus spp.)分离株产AFB₁的特性。【方法】采用马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)对鱼干中的曲霉菌进行分离纯化,根据菌落形态、显微形态观察和ITS序列分析对分离株进行鉴定,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析菌株的AFB₁合成量。【结果】鱼干中曲霉菌的分离率高达47.66%,经形态学鉴定发现以黄曲霉(Aspergillus flavus)A03、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H32、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M23、欧式曲霉(Aspergillus europaeus)M11、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)B21等为主,其中红笛鲷干(Lutjanus sanguinaus)中黄曲霉菌的含量高达1200 CFU/g。黄曲霉A03在红笛鲷干培养基中常温(27~30℃)培养21 d,产AFB₁能力达到3.8 ng/mL。【结论】鱼干中存在产AFB₁的黄曲霉菌,警示鱼干中存在AFB₁污染的风险。     

CO2协同低温有水对卵形鲳鲹麻醉保活效果的影响

【目的】探究二氧化碳CO₂麻醉协同低温对卵形鲳鲹有水保活的影响,延长卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)的保活时间。【方法】研究保活过程中CO₂质量浓度、麻醉时间、麻醉温度和鱼质量水比对卵形鲳鲹有水保活时长的影响;在最佳麻醉保活条件下,测定其血清生化指标、肌肉及肝脏氧化应激指标及代谢指标。【结果】卵形鲳鲹在16℃、100 mg/L CO₂水溶液中麻醉3 min其麻醉效果最佳。在15℃低温下进行有水保活,鱼水质量比为2∶1,存活时间最长,为(359±2)min,此条件下复苏率达100%。经过CO₂麻醉协同低温有水保活后的卵形鲳鲹血清谷草转氨酶(GOT)活性显著升高(P<0.05)、尿素氮(BUN)和甘油三酯(TG)含量上升,血糖含量下降。肌肉中的乳酸脱氢酶(LDH)活性显著上升(P<0.05),乳酸(LD)和糖原含量上升,过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量下降;肝脏中的LDH活性显著上升(P<0.05)、CAT活性和LD的含量上升,MDA和糖原的含量下降。【结论】CO₂协同低温有水对卵形鲳鲹有较好的麻醉效果,有助于保活运输。在保活过程中卵形鲳鲹通过提升能量代谢水平和抗氧化能力应答环境应激,在一定程度上影响卵形鲳鲹保活过程的存活时间。     

斜生栅藻对全氟辛酸和Zn2+联合胁迫的生理生化响应

【目的】探究全氟辛酸(PFOA)与重金属锌(Zn²⁺)单一及联合暴露对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的急性毒性效应和作用机制,为全氟化合物(Perfluorinated compounds,PFCs)和重金属在水生生态系统中的联合风险评估提供理论基础。【方法】将1×10⁶mL^-1斜生栅藻分别在0～16 mg/L Zn²⁺、0～350 mg/L PFOA单一处理组及0～1.5 TU联合处理组暴露96 h,分析暴露条件对斜生栅藻的细胞浓度、藻细胞叶绿素a(Chl a)、总蛋白(TP)含量、抗氧化系统、细胞外部形态、转化氨氮能力、Zn²⁺与PFOA去除率等指标的影响。【结果与结论】处理96 h,Zn²⁺与PFOA单一胁迫抑制斜生栅藻生长的半最大效应质量浓度(96 h-EC₅₀)分别为14.17 mg/L和198.98 mg/L;二者联合胁迫96 h-EC₅₀为0.97 TU,作用模式为部分相加作用...