创伤弧菌内膜脂蛋白MFP4的克隆、表达及细胞定位研究

创伤弧菌是一种海洋环境中的重要病原菌。细菌脂蛋白是一类细菌重要的具有不同生理功能的膜蛋白,以大肠杆菌为代表的经典革兰氏阴性菌脂蛋白分泌规律遵循“+2规则”。为探究海洋环境中革兰氏阴性菌的细菌脂蛋白分泌机制是否有别于其他环境中的革兰氏阴性菌,本研究克隆并表达了创伤弧菌的MFP4脂蛋白,该脂蛋白N端成熟肽段第二位(+2位)氨基酸为甘氨酸,根据“+2规则”理论上应定位于细胞外膜。实验利用细菌外膜小体分离鉴定法,在表达MFP4重组脂蛋白的创伤弧菌中对其进行细胞定位后发现, MFP4生物合成后定位于细胞内膜。实验进一步构建了MFP4蛋白N端序列与红色荧光蛋白RFP的融合脂蛋白基因MFP4tether-RFP并在创伤弧菌中表达,细胞定位结果发现该重组融合脂蛋白仍然定位于细胞内膜,说明MFP4成熟脂蛋白的N端携带内膜细胞定位的信息。实验同时构建并表达了外膜脂蛋白LptE的N端序列与RFP的融合重组脂蛋白LptEtether-RFP,该蛋白具有与MFP4相同的N端+2位氨基酸(Gly+2),与MFP4 tether-RFP融合脂蛋白仅有(+3—+10位)8个氨基酸序列的差异。实验发现该融合脂蛋白定位于...     

豚鼠气单胞菌CB101的GlcNAc利用系统及调控蛋白NagC对chiI转录的调控

L8和L10是豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)CB101的两株转座子突变株,突变位置发生在nagA基因,可以组成型表达几丁质酶.我们构建了基因文库,利用Southern杂交从中筛选到一个克隆子包含了三个基因:nagB、nagA和nagC.序列分析显示nagBAC的转录方向相同,而且基因的间隔仅有几个碱基.根据已有报道我们推测NagC是几丁质酶的转录调控蛋白,转座子插入nagA破坏了下游的调控蛋白基因nagC的转录和表达,从而几丁质酶成为组成型表达.我们通过构建NagC缺失突变株、凝胶阻滞迁移以及对NagC氨基酸序列的分析初步证明了NagC属于ROK(repressors,opening reading frames,and kinases)家族的调控蛋白,是chiI的转录阻遏因子.     

可口革囊星虫(Phascoloma esculenta)铁结合蛋白基因的研究

根据已报道的铁结合蛋白基因的保守序列设计引物,用cDNA末端快速扩增(RACE)法,成功地从可口革囊星虫体液中获得铁结合蛋白基因的全长序列.结果表明,该基因cDNA全长1017bp,5'-端非编码区为15lbp,3'一非编码区为341bp,开放阅读框长度为525bp(括一个终止密码子),可编码175个氨基酸(GenBank:EU091352).该序列与加洲海兔、皱纹盘鲍、刺参、微小牛蜱、叉尾鲴、非洲爪蟾、小家鼠、人等的铁结合蛋白基因有67%-75%的同源性,而相应的氨基酸同源性为59%-76%.氨基酸相似性为74%*-89%%.分析结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中是高度保守的.     

大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆、表达及其特征分析

EF-hand结构域在真核生物细胞内钙离子吸收和运输中发挥重要作用,在贝类中可能参与贝壳和珍珠质的形成。根据已报道的贝类中具有EF-hand结构域的碱基序列设计简并引物,从大珠母贝外套膜cDNA文库中筛选得到PMMG1基因(大珠母贝外套膜基因1)。PMMG1基因全长618 bp,开放读码框编码140个氨基酸,N-端的22个氨基酸肽段为信号肽。PMMG1氨基酸序列与合浦珠母贝PFMG1的一致性为56%,预测有两个EF-hand结构域。选取编码PMMG1成熟蛋白的cDNA序列插入pET-32a质粒构建表达载体,通过IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,成功获得预期大小的融合蛋白。凝胶电泳迁移率的变化证明PMMG1蛋白具有结合Ca2+/Mg2+的活性,组织特异性表达表明PMMG1基因在外套膜的表达量远高于其他组织。大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆与表达研究为进一步研究该蛋白在珍珠质矿化中的作用、探讨珍珠质形成的分子生物学机制奠定了一定基础。     

单环刺螠转录因子基因Sp8的克隆、原核表达和重组蛋白纯化

转录因子Sp是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员,可与某些基因的上游调控序列结合,参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得单环刺螠的Sp8的全长cDNA,该序列长1 913bp,开放阅读框1 521bp,编码506个氨基酸;将其开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达4h,获得以包涵体形式存在的重组蛋白pET28a-SP,使用8mol/L尿素溶解包涵体,并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白,SDS-PAGE分析该蛋白的分子量约为50kD。Sp8蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。     

眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析

肌肉生长抑制素(MSTN)基因对肌肉生长起负调控作用,在动物育种上具有潜在的应用前景.报道了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的MSTN基因的序列结构特征及其组织特异性表达.MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码376个氨基酸.在内含子Ⅰ和3'-UTR区内,分别发现了(TC)₄CC(TC)₄CT(TC)₄和(AC)₇微卫星序列.推断的眼斑拟石首鱼的MSTN氨基酸序列具很强的保守性,与石鼓鱼、金鲷、条纹石鮨、白鲈、金眼石鮨之间的相似性在90%以上.在结构上,眼斑拟石首鱼的MSTN包含N端信号序列(1~22氨基酸残基),TGF-β前肽域(41~256氨基酸残基),RXXR蛋白水解位点(264~267位的RARR)和TGF-β区域(282~376氨基酸残基).在检测的10种组织中,MSTN只在眼斑拟石首鱼的肌肉、脑和眼组织中表达,其中在肌肉表达最强.     

日本囊对虾Cathepsin L基因的鉴定及其在幼体发育中的表达研究

本研究从日本囊对虾（Marsupenaeus japonica）中获得半胱氨酸蛋白酶家族中的cathepsin L基因,命名为Mj-Cathepsin L。Mj-Cathepsin L基因cDNA序列全长1191bp,其开放阅读框编码的Cathepsin L蛋白前体包含327个氨基酸,由信号肽,蛋白前体和成熟蛋白三部分组成。同源序列比对发现日本囊对虾Cathepsin L蛋白与其他已知物种的cahtepsin L蛋白具有较高的同源性。对Mj-Cathepsin L基因在不同组织以及早期幼体幼体发育阶段的研究发现,Mj-Cathepsin L主要在肝胰腺中大量表达,且在幼体发育不同阶段,其表达水平受发育阶段调控,且Mj-Cathepsin L基因显示出与其五个蜕皮时期相关的表达变化,说明Mj-Cathepsin L有可能在日本囊对虾个体发育过程中扮演不同的重要作用。并通过Western Blot方法在日本囊对虾肝胰腺,胃和肠中检测到Cathepsin L酶原和成熟Cathepsin L两种蛋白存在形式。     

绿海龟（Chelonia mydas）α-actin基因的cDNA克隆与序列分析

为探究绿海龟（Chelonia mydas）α-actin基因序列的相关信息,利用RT-PCR和RACE方法从绿海龟肌肉组织中获得了α-actin基因的cDNA全长序列,共1347bp（GenBank登录号为JX073650）。所得序列包含一个1134bp的开放阅读框,编码由377个氨基酸组成的蛋白,该蛋白7-377位为Actin结构域,14-17位有一个糖基化位点,无信号肽;预测分子量为42.0kDa,理论等电点为5.23。将编码区序列与GenBank上同源序列进行比对发现,核苷酸序列相似性均在85.4%以上,氨基酸序列相似性均在98.9%以上,说明α-actin基因作为编码蛋白是高度保守的。系统发育分析表明,绿海龟α-actin基因与两栖类亲缘关系较近,而与鱼类亲缘关系较远。本研究丰富了actin基因的资料库,为进一步研究相关基因的表达及功能奠定了基础。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin在巴斯德毕赤酵母中的表达及其产物的抑菌活性

Hepcidin是一类具有独特性质的小分子抗菌肽,克隆得到大黄鱼(Pseudosciana crocea)的hepcidin基因(Lyc-Hepc),cDNA序列全长585个核苷酸,编码一个由85个氨基酸组成的蛋白,包含24个氨基酸的信号肽、35个氨基酸的前导肽和26个氨基酸的成熟肽,成熟肽具有8个保守的半胱氨酸.将Lyc-Hepc 183bp的编码前导肽和成熟肽的前体肽(25aa-85aa)基因片段克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,然后电击转化巴斯德毕赤酵母SMD1168,经高浓度Zeocin筛选获得多个单克隆.挑取4个克隆进行培养,提取酵母基因组进行PCR检测,结果表明目的基因片段已成功整合到酵母菌SMD1168基因组中,获得酵母工程菌株SMD1168/pP1CZα-Lyc-Hepc.SDS-PAGE和WesternBlot分析表明酵母工程菌株在0.5％甲醇诱导培养72h后,Lyc-Hepc在培养上清中得到了分泌型表达.体外抑菌实验表明重组Lyc-Hepc蛋白能够抑制2株水产养殖病害菌嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的生长.研究结果表明大黄鱼hepcidin可能在抗细菌免疫中发挥了作用.     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Akt/PKB 基因在病原刺激下的表达和功能分析

本文在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上,克隆获得了其Akt/PKB基因(FcAkt)的开放阅读框(ORF)的cDNA序列,分析了对虾FcAkt基因的结构特征,并利用实时定量RT-PCR技术分析了FcAkt基因在鳗弧菌、溶壁微球菌和白斑综合征病毒(WSSV)注射后的转录表达变化。结果表明,中国明对虾FcAkt基因的ORF全长为1536bp,编码511个氨基酸,预测蛋白分子量为58.9kDa,理论等电点pI为5.60。同源比对显示该基因的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性。进化分析发现FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B(Akt/PKB)亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV刺激后具有明显的变化,提示对虾FcAkt基因可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。     

西太平洋多金属结核区表层沉积物细菌群落结构及其对沉积扰动的响应

本文基于大洋第48航次在西太平洋马尔库斯 威克海山多金属结核区采集的6个表层沉积物样品的高通量测序结果,开展底栖细菌群落结构调查,共获得253012条序列,分属于41个门、85个纲、189个目、261个科和322个属。其中,变形菌纲(Proteobacteria)为优势类群,分为γ 、α 和δ 三个亚群,分别占总序列条数的24.76%、20.21%和6.48%。绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)及硝化螺旋菌门(Nitrospirae)等类群的序列数和属种较丰富。对序列条数大于1%的OTU(operational taxonomic units)分析,共获得优势菌群23个目,包含6个优势科,10个优势属,其中,铁锰功能细菌占10.20%,主要来自交替单胞菌属(Alteromonas)(6.90%)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)(1.80%)和希瓦氏菌属(Shewanella)(1.00%)等,另外还存在参与氮和硫元素循环的种属。PICRUSt功能预测分析显示结核区细菌主要涉及信号转导、蛋白转运、原核生物固碳、群体感应、能量转换、氨基酸和嘧啶代谢等功能。BC1826站位与其他站位相比,细菌多样性较低。结合沉积柱粒度分析结果,推测BC1826站位微生物群落结构的差异与沉积扰动有关,两者具有一定的响应关系。与已有研究成果汇总对比发现,西太平洋结核区与东太平洋结核区的细菌群落组成结构有较大差异。     

松江鲈肌酸激酶的基因克隆、表达与功能分析

前期蛋白质质谱分析发现，松江鲈（Trachidermus fasciatus Heckel）经鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激后，其皮肤黏液中的肌酸激酶（creatine kinase，CK）的表达明显上调。目前，肌酸激酶在鱼类中的功能研究尚未深入开展。本文利用RACE技术克隆获得了松江鲈CK基因的全长cDNA序列（命名为TfM-CK）。TfM-CK基因的cDNA全长为1 474 bp，开放阅读框为1 146 bp，编码381个氨基酸。序列比对分析显示，TfM-CK序列高度保守。实时荧光定量PCR显示，TfM-CK mRNA广泛表达于松江鲈各组织，在肌肉中的相对表达量最高，其次为血液。鳗弧菌刺激后，TfM-CK mRNA在肌肉、皮肤、脾脏和头肾中均上调表达。其中，脾脏中的表达量高达对照组的900多倍。原核重组表达纯化的TfM-CK （rTfM-CK）蛋白酶活测定实验结果显示，重组蛋白的酶活为22.0 U/mg。rTfM-CK对鳗弧菌、大肠杆菌（Escherichia coli）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有较强的凝集作用。由以上实验结果推测，TfM-CK可能通过细菌凝集作用参与到了松江鲈抵抗病原菌的先天免疫防御过程中。本研究为认识鱼类肌酸激酶的功能及其在病原菌防御过程中的分子免疫机制机制提供了参考。     

福鼎海域坛紫菜叶状体体表外生细菌的组成和数量分析

从采集自福鼎敏灶湾和硖门湾海域的健康坛紫菜（Porphyra haitanensis）叶状体体表分离、纯化到26株外生细菌．根据细菌菌落特征、菌体形态和16SrDNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定,将其确认为6种不同的菌属,分别是假交替单胞菌属（Pseudoaheromonas）、Aquimarinas属、交替单胞菌属（Aheromonas）、黄杆菌属（Flavobacteriums）、弧菌属（Vibrio）和嗜琼胶菌属（Agarivorans）．2个海湾坛紫菜叶状体体表外生菌群数量稳定且差别不大,外生细菌菌属组成基本相同,个别菌属稍有差异,优势菌属为假交替单胞菌属和Aquimarinas属,常见菌属为交替单胞菌属和黄杆菌属,少见菌属为弧菌属．敏灶湾坛紫菜体表外生菌群数量为（5．7～6．5）×10^4cfu／g,外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占38．5％,Aquimarinas属占52．8％,交替单胞菌属占13．9％,黄杆菌属占11．5％,弧菌属占3．3％．硖门湾坛紫菜体表外生菌群数量为（6．4～7．6）×10^4cfu／g,外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占37．3％,Aquimarinas属占32．0％,交替单胞菌属占14．0％,黄杆菌属占12．7％,弧菌属占2．7％,嗜琼胶菌属占1．3％．优势和常见菌属菌株对健康坛紫菜叶状体进行感染,发现这些菌株对坛紫菜叶状体无致病力,叶状体生长无异常．这些可为坛紫菜微生物学研究提供基础资料．     

东南太平洋热液区硫化物样品富集培养物中Fe3＋还原细菌的多样性分析

采集了东南太平洋热液区DYl15-20V一$35一TVGl7站位的沉积物硫化物样品,其含有76．717％（m／m）强还原性的磁性良好的黄铁矿．以乳酸钠为电子供体,不溶性的氢氧化铁为电子受体,对该样品进行Fe¨还原细菌的定向富集培养．通过构建该茵群的16SrDNA基因文库,随机挑选82个阳性克隆子进行群落结构多样性分析．研究结果表明：82个克隆代表的6种基因型分别属于4个主要类群,其中ε一变形杆菌占有绝对优势,达到55．2％．此外其还包括厚壁菌门、β一变形杆菌和仅．变形杆菌,克隆子比例依次为27．6％、10．3％、6．9％．在富集产物中还原氢氧化铁的功能菌群主要是具有硫还原作用的ε一变形菌中的硫还原菌．     

稀杯盔形珊瑚钙网蛋白基因的克隆及功能分析

钙网蛋白（calreticulin，CRT）是高度保守的内质网钙结合蛋白和分子伴侣，主要参与调节钙离子水平和指导蛋白质正确折叠。在这里，我们克隆稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）的CRT基因，命名为Gacrt，并分析其促进细菌凝集的能力。Gacrt全长1792bp，其中5’端非翻译区(5''UTR)为77 bp，3’端非翻译区(3''UTR)为380bp，开放阅读框(ORF)1335bp，编码444个氨基酸残基，包含信号肽结构域、内质网检索信号序列（KDEL）、两条保守的钙网蛋白家族结构和一组三重复序列。通过构建原核表达系统得到CRT重组蛋白，纯化后的重组蛋白可以促进革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌凝集，具有细菌凝集活性，支持GaCRT作为免疫相关分子参与机体对细菌防御的观点。     

Voltammetric estimation of iron(III) thermodynamic stability constants for catecholate siderophores isolated from marine bacteria and cyanobacteria

Thermodynamic stability constants have been estimated for the complexation of iron(III) with catecholate-type siderophores isolated from the marine bacterium Alteromonas luteoviolacea and from the marine cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Stability constants were determined utilizing the “chelate scale” of Taylor et al. (1994). The scale is based upon a linear relationship between the reduction potentials and the pH-independent thermodynamic stability constants for known iron(III) complexes. Log K values for the alterobactin B ferric iron complex are 43.6 ± 1.5 at pH 8.2 and 37.6 ± 1.2 at pH 6, consistent with a shift from bis-catecholate to monosalicylate/monocatecholate iron coordination with decreasing pH. Synechococcus isolates PCC 7002 Nos. 1 and 3 formed iron(III) complexes with stability constants of approximately 38.1 ± 1.2 and 42.3 ± 1.5, respectively. The binding strengths of the iron(III) complexes examined in this study are quite high, suggesting that catecholate siderophores may play a role in the solubilization and biological uptake of iron in the marine environment.     

长江口及邻近陆架区沉积物和间隙水中铁及其与细菌的关系探讨

本文通过对长江口及邻近陆架区12个站位的柱状沉积物、间隙水和细菌资料分析,指出了研究区沉积物和间隙水中铁的分布特征,并与细菌、地质资料对比研究、从生物地球化学角度对间隙水中铁的来源及其控制因素作了初步探讨。资料研究表明,沉积物中铁主要赋存于细粒沉积物中,腐植酸中铁由河口向陆架减少。间隙水中铁主要来自沉积物中高价铁,在弧菌科(Vibrionaceae)和假单孢菌属(Pseudomonas)细菌的媒介下,参加了沉积物中某些有机物的降解反应,接收了有机物的电子后被还原,其含量和分布主要受控于参加媒介作用的细菌。     

赤点石斑鱼HSP60基因克隆及弧菌应激前后的组织表达特性分析

HSP60(heat shock protein 60,热休克蛋白60)作为高度保守的热休克蛋白家族的一员,不仅可以在应激状态下帮助其他蛋白正确折叠并恢复天然构象,还可作为危险信号作用于天然免疫系统.基于HSP60的EST序列设计特异引物,采用RACE技术成功克隆获得赤点石斑鱼HSP60 cDNA全序列及基因组全序列....     

含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌毒力的影响

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌, 广泛分布于海洋环境中, 能够引起肠胃炎、伤口感染以及败血症, 是人类重要的病原菌之一。宿主体内被认为是一种低铁环境, 能够激发致细菌的毒力。副溶血弧菌能够分泌弧菌素或利用外源铁载体来获取铁。在低铁条件下, 编码双组份调控系统的基因簇VPA0148-VPA0149转录上调, 使含铁肠杆菌素受体PeuA转录出有活性的蛋白。VPA0148编码产物为一个响应调节因子, 具有一个磷酸基团接收结构域和一个DNA结合结构域。本研究发现, VPA0148的缺失增强了菌株的生物膜形成能力和对斑马鱼的致死能力, 同时能够促进菌株在低铁环境中的生长, 并增强菌株的群集运动。研究结果表明含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌致病力具有调控作用, 增进了对铁调节副溶血弧菌毒力机制的认识。