褐牙鲆、夏鲆及其杂交子代核型与DAPI 带型分析

为了深入剖析褐牙鲆与夏鲆杂交后代的染色体结构,本研究利用秋水仙素-低渗-空气干燥法制备胚胎染色体和DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)荧光染色的方法,对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、夏鲆(Paralichthys dentatus)及其正反交子代胚胎细胞的染色体组型和染色质的分布进行了研究。结果表明,褐牙鲆、夏鲆及其正交子代(褐牙鲆♀×夏鲆♂)染色体组均含有48条端部着丝粒染色体,染色体组型公式均为2n=48t,组内染色体长度分布连续,三者核型相似。反交子代(夏鲆♀×褐牙鲆♂)为46条端部着丝粒染色体,比亲本及正交子代少了两条染色体。DAPI荧光染色显示,褐牙鲆1号染色体中的一条染色体有较明显的次缢痕,夏鲆及正反交子代染色体中未见明显次缢痕。褐牙鲆与正交子代染色体着色较为均一,而夏鲆与反交子代着丝粒区域亮度明显增强。     

人工诱导雌核发育牙鲆的染色体及核型证明

于1994-1996年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的3－5龄牙鲆亲鱼,采用紫外线照射法使牙鲆精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙好。原肠期采用空气干燥法、Giemsa染色,得到雌核发育二倍体、正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙鲆的雌核发育二倍体和正常二倍体的染色体数均为2n=48,核型为48t,即48条端部着色点染色体,臂数NF=48,两者的核型设有明显差异;单倍体为24条端部着丝点染色体;在3个组别中,第一号染色体上都有一明显的次缢痕。雌核发育二倍体牙鲆的诱导率为98％。     

牙鲆与夏鲆杂交及回交子代胚胎发育及早期生长比较

通过人工授精技术对牙鲆(Paralichthys olivaceus )和夏鲆( Paralichthys dentatus )进行了正反交及回交实验,并比较了正反交、回交子代的胚胎发育时序和仔稚幼鱼的生长.结果表明:孵化水温18.0±0.5℃下,初孵仔鱼破膜用时为:牙鲆41 h,正交鲆47 h,回交牙鲆42 h30 min,回交夏鲆44 h;16.5±0.5℃下,夏鲆61 h 40 min,反交鲆66 h.正交及两组回交子代在胚胎期均可正常发育.反交子代卵裂期出现异常,仅少数胚胎可以孵化.胚胎孵化后,在1~64日的培养过程中,反交鲆于3~4 d 内全部死亡,回交牙鲆发育至18日龄时全部死亡.正交鲆和回交夏鲆可正常发育,与牙鲆没有明显差别     

三倍体牙鲆的核型证明

于1990，1993 - 1994年以捕自青岛近海的牙鲆亲鱼，采用冷休克法（0－4°C）进行多倍体的人工诱导实验，以期掌握牙鲆细胞遗传学特征和研究遗传育种方法。通过实验得到了三倍体牙鲆并进行培育。在原肠胚期采用空气干燥法、Giemsa染色获得正常二倍体、三倍体的染色体制片。镜检得，牙鲆二倍体染色体以2n=48，均为端部着丝点染色体，核型为24t，其管数NF=48；三倍体的染色体3n=72，也都为端部着丝点染色体，其臂数NF=72，并依据二倍体的枝型得出了三倍体的核型图。     

杂交鲆(牙鲆♀×夏鲆♂)胚胎发育的初步观察

通过人工调控促使亲本牙鲆(Paralichthys olivaceus)♀×夏鲆(Paralichthys dentatus)♂的性腺发育,人工干法授精获得杂交受精卵。杂交受精卵在温度为16.5~17.5℃,光照为100~400 lx,微充气条件下孵化。对杂交鲆胚胎发育全过程进行连续观察并与牙鲆及夏鲆的胚胎发育进行比较。结果表明:杂交鲆卵裂方式与其他大部分硬骨鱼类一样,属于盘状卵裂。受精后经过2 h 30 min进入2细胞期,7 h 45 min进入囊胚期,15 h 10 min进入原肠胚阶段,25 h 30 min进入神经胚期,49 h左右进入尾芽期。授精后63 h左右发现初孵仔鱼,68h左右50%的仔鱼孵出。在杂交鲆的胚胎发育中,主要有2个发育特征与母本类似而与父本不同:视囊的出现要早于体节的分化;孵化前,仔鱼在卵膜内环绕卵黄囊不到1周。但是在其孵化时间上却与父本相似。     

军曹鱼染色体组型分析

为了解军曹鱼(Rachycentron canadum)的细胞遗传学特征,采用植物血球凝集素(PHA)、秋水仙碱胸腔注射,取头肾细胞经空气干燥法制片,分析了军曹鱼染色体核型。结果表明,军曹鱼核型为:2n=48=48t,染色体总臂数(NF)为48。     

真鲷、黑鲷及其杂交子代的染色体构成与AFLP分析

采用核型分析和AFLP技术对真鲷、黑鲷及其杂交子代进行遗传差异分析。结果显示真鲷、黑鲷和杂交子代均含有48条染色体,核型分别为2n=2st+46t,NF=48、2n=4m+4sm+2st+38t,NF=56和2n=30m+8sm+2st+8t=48,NF=86,杂交子代核型与其父、母本种均不一致。两对AFLP选扩引物组合在真鲷、黑鲷和杂交子代中共扩增到278个条带,其中黑鲷特异性条带93条、真鲷特异性条带108条;杂交子代中分别出现了21条父本种(黑鲷)特异条带和67条母本种(真鲷)特异条带,另出现了15条非双亲条带。杂交子代与真鲷、黑鲷的遗传相似系数和遗传距离分别为0.113、0.350和2.180、1.050,表明杂交子代总体上更偏向于母本种。染色体核型和AFLP条带分析结果表明真鲷(♀)×黑鲷(♂)所获得的杂交子代为含有48条染色体的异源二倍体,且父、母本遗传物质在杂交中发生了部分重组,杂交子代表现出一定的偏母系遗传特性。     

4种石斑鱼染色体核型研究

以蜂巢石斑鱼(Epinephelus merra)、鲑点石斑鱼(Epinephelus fario)、点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)及黑边石斑鱼(Epinephelus fasciatus)为材料,胸腔注射PHA及秋水仙素溶液,取头肾细胞经空气干燥法制片。经核型分析,蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼核型一样,2n=48=4m 6sm 4st 34t,NF=62;点带石斑鱼与黑边石斑鱼的核型一样,2n=48=48t,NF=48。由染色体数目2n=48可知,4种石斑鱼在鱼类系统中划分为高位类;由核型组成不同,可以将4种石斑鱼分为两大类：蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼属于一大类;点带石斑鱼与黑边石斑鱼属于另一大类。此外,按总臂数多少来分,蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼为特化类群：点带石斑鱼与黑边石斑鱼为原始类群。     

金虎杂交斑三倍体血细胞特征及染色体核型分析

为了解三倍体金虎杂交斑(棕点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀×蓝身大斑石斑鱼E. tukula♂)的细胞遗传特性。以静水压休克诱导的三倍体金虎杂交斑为研究对象,通过细胞DNA含量测定鉴定出三倍体金虎杂交斑、对三倍体金虎杂交斑进行红细胞大小、形态的比较及染色体核型分析。结果显示,三倍体金虎杂交斑的DNA含量与二倍体金虎杂交斑的DNA含量的比值为1.45︰1。三倍体金虎杂交斑血细胞长轴、短轴分别为二倍体的1.34、1.14倍(P<0.01)。三倍体金虎杂交斑血细胞体积、表面积分别为二倍体的2.07和1.54倍(P<0.01),三倍体金虎杂交斑血细胞核长轴、短轴、核表面积、核体积分别为二倍体的1.22、1.05、1.29、1.57倍(P<0.01)。通过头肾-秋水仙素注射法进行染色体核型分析结果显示,二倍体金虎杂交斑的染色体数目为48,核型为2n=48=2sm+46t, NF=50,三倍体金虎杂交斑的染色体数目为72,核型为3n=72=1m+2sm+69t,NF=75,未发现有性染色体。实验结果为石斑鱼杂交种多倍体育种提供了丰富生物学基础数据。     

雌性虾夷扇贝与雄性栉孔扇贝杂交子代及其亲本的核型研究

采用滴片法制片-吉姆萨染色对雌性虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)与雄性栉孔扇贝(Chla-mysfarreri)杂交子代及其双亲的核型进行了研究,报道了在扇贝杂交过程中产生的特殊的细胞遗传学现象,结果表明,栉孔扇贝染色体核型2n=38=6m+10sm+22st;虾夷扇贝染色体核型2n=38=6m+10sm+16st+6t;两者杂交子代染色体数目2n=38,但其染色体组型不符合预期型,不是简单地由两个亲本各自一套染色体组型组合而成,呈现出复杂的形态多态性,端部着丝点染色体明显增多.     

牙鲆幼鱼越冬饲养期环境因子研究

本文重点研究牙鲆鱼越冬饲养期间所需的适宜温度和盐度条件,以及牙鲆对酸碱度的耐受力。研究结果表明温度是影响牙鲆在越冬期标准代谢的主要环境因子。７～１４．５℃是越冬期牙鲆能量代谢变动最低的温度区间,也是最适宜的温度范围。盐度也是影响牙鲆越冬期的环境因子,在７～１４．５℃的温度条件下,其盐度阈值下限为２０;４０仍属适宜盐度。牙鲆的耐酸力比耐碱性强,９６ｈ和４８ｈ致死的ｐＨ值分别为４．４５和４．２０,当ｐＨ值为９．３０时,牙鲆１６ｈ死亡。     

养殖牙鲆淋巴囊肿病的电镜观察

对养殖牙鲆中发生的似淋巴囊肿病进行了细 胞的电镜超微结构观察。结果指出,在囊肿细胞内有大量形态一致、大小为260～270nm的典 型虹彩病毒。因病毒的形态和大小与国外报道的淋巴囊肿病毒相同,故研究从电镜学的角度 确认供试牙鲆所患疾病是淋巴囊肿病(Lymphocystis disease,LD),该病毒为虹彩病毒科的 淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LDV)。该项工作系国内首次全面报道了病鱼主 要组织细胞的电镜观察结果,发现LD病毒存在于囊肿、心脏、头肾、脾脏、肠和鳃中。     

Genetic analysis of meio-and mito-gynogenetic stocks of Paralichthys olivaceus with microsatellite markers

Twenty microsatellite markers （ Pol, Po13, Po33, Po35, Po42, Po48, Po56, Po89, Po91, kop6, kop7, kop8, kop12, kop15, kop18, kop21, kop22, kop23, kop26, Po-str1 ） were used to assess the meiogynogenetic and mitogynogenetic stocks of the lefteyed flounder, Paralichthys olivaceus, which were derived from single pair crossing. Twelve of the 20 loci utilized showed heterozygosity in the female and were mapped in relation to their centromeres in the meiogynogenetic diploid flounder. Microsatellitecentromere map distance, calculated under the assumption of complete interference, ranged from 15. 8 cM for kop22 to 50 cM for Po13, Po56 and Po89. Excluding the kop22, the heterozygosities of the rest of the loci were close to 100% , suggesting the occurrence of near complete interference on the chromosome arms that carried these loci. In the mitogynogenetic diploid flounder, each individual showed exact homozygousity and the segregation profiles did not deviate from the Mendelian 1：1 pattern. The results indicated that there was no lethal gene linked with the loci analyzed. Such high interference accounted for the high recombination rates and large map distances. The Po13 and Po56 loci, Po91 and kopl8 loci, kopl5 and kop21 loci are tightly linked on the same chromosome arm in pairs.     

基于核磁共振的褐牙鲆幼鱼组织代谢组学分析

基于核磁共振的代谢组学技术是系统生物学研究的重要组成部分,近年来已被广泛应用于海洋生物学中。由于海洋环境具有高盐度的特点,海洋生物与其他生物相比,体内代谢物浓度差异极大。通常来说,海洋生物为应对高盐度的海水环境,其体内的渗透调节物,例如牛磺酸、甜菜碱、氮氧三甲胺等的浓度往往是其他代谢物的数百倍,造成体内代谢物所占代谢组权重的极不均衡。因此,选择合适的代谢组数据预处理方法,是准确分析海洋生物代谢组差异的关键。本研究以褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼为研究对象,经低盐胁迫48小时后,利用一维核磁共振氢谱,分析了褐牙鲆幼鱼全组织在低盐胁迫后的代谢组变化,比较了三种不同预处理方法 (单位方差换算、帕莱托换算与对数化-中心化处理)对于低盐胁迫诱导的代谢响应分析的差异。结果表明,褐牙鲆幼鱼体内的渗透调节物-氮氧三甲胺浓度是其他代谢物浓度的200倍以上,而低盐胁迫可诱导褐牙鲆幼鱼体内显著的代谢响应。其中,对数化-中心化处理的代谢组数据,经正交偏最小二乘判别分析后,能发现8个低盐胁迫诱导的差异代谢物(不含1个未知代谢物),与代谢物定量结果一致,多于其他两种预处理方法 (单位方差换算、帕莱托换算)的代谢组分析结果,适合用于褐牙鲆代谢组学分析。以上研究结果为褐牙鲆代谢组数据的准确分析提供了方法学依据。     

漠斑牙鲆生物学及其养殖研究进展

漠斑牙鲆原产于美国沿海,美国自90年代初开始研究漠斑牙鲆的繁育及其养殖技术。近年来,我国从美国引进漠斑牙鲆进行培育。本文对国内外漠斑牙鲆生物学及其养殖的研究进行了总结,提出了漠斑牙鲆今后研究的方向。     

三个牙鲆育种群体亲本效应及遗传参数估计

针对牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖品种生长速度变慢、抗病力降低这一问题。近年来构建了牙鲆抗病群体(RS)、日本群体(JS)和黄海群体(YS)3个育种群体,开展牙鲆选择育种,建立了63个家系,收集了所有家系5 328尾鱼苗的体长和体重数据。借助线形混合模型(Linear mixedmodel)、"加性-显性"模型、约束极大似然法(REML)及最佳线性无偏预测(BLUP)分别估计亲本效应值、体重和体长遗传力和遗传相关、父母本效应和杂交效应。预测结果显示,其中父本130,141,146,170,218,229,303和308随机效应达到了极显著效应水平(P<0.01),父本112,122,141,190,212达到显著水平(P<0.05),所有母本体重随机效应达到了极显著水平(P<0.01);体长和体重两性状的加性、显性、表型和基因型相关分量都达到极显著水平(P<0.01),体长和体重的加性方差比率均大于显性方差比率,可见两性状的遗传效应主要取决于基因的加性效应。体长的总遗传效应率为31.20%,体重的总遗传效应率为33.58%,体长和体重的随机方差比率分别达到68.80%和66.41%,说明养殖环境等因素对牙鲆体长和体重的影响较大,同时说明在牙鲆选择育种中消除环境影响极为重要。体长和体重的狭义遗传率分别为0.199和0.256(P<0.01),广义遗传率分别为0.312和0.336(P<0.01),牙鲆在以上两性状上属于中等遗传力,通过选择育种可取得较大的遗传进展。对3个牙鲆育种群体杂交随机效应估计结果显示,抗病群体和黄海群体在体长和体重两性状上加性随机效应显著(P<0.05);抗病群体分别与日本群体、黄海群体杂交,其后代表现出显性随机效应达到0.10的水平(P<0.10),黄海群体自交、日本群体和黄海群体杂交随机效应不显著(P>0.05),因此在杂交组配中选择抗病群体与其他两个群体交配可取得较好的效果。     

First isolation and characterization of a new species of Vibrio from diseased flounder (Paralichthys olivaceus Temminck et Schlegel)

Appropriate pathogenic bacteria were isolated from diseased (or dead) flounder (Paralichthys olivaceus L) occurring in a mariculture farms of Qinhuangdao, which all diseased fishes expressed bacterial septicaemia. The phenotypic information of the 12 pure cultures was studied extensively, including morphological characteristics, colony characteristics in different media, physiological and biochemical characteristics, and the mole fraction G C ratio of the DNA for representative strain. The results show that the isolates belong to a new species of Vibrio, and are designated as Vibrio qinhuangdaora sp.nov, by the area from which the diseased flounders are collected (Qinhuangdao) based on its biological properties following Rules of International Code of Nomenclature of Bacteria. At the same time,studies on the serum homology ofisolates, and pathogenicity of isolates were conducted by experimental infection. The results show that all the isolates are of serologic similarity, and the isolates have strong pathogenicity to flounder. The studies can extensively reflect the main biological properties of this new species of Vibrio.     

养殖牙鲆细菌性病原分离与鉴定

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国北方沿海地区的重要经济养殖品种，目前已形成工厂化生产规模。随着养殖密度的增加以及海水污染程度的日益严重，养殖牙鲆出现了各种疾病(曲凌云等，2000； Mo Zhaolan et al.，2001).造成了巨大的经济损失。 1999~2000年，山东省荣成、威海、青岛胶南及黄岛地区养殖牙鲆大面积发病，疾病发生时间多在每年的6~11月.病鱼多为3~10月龄。本文作者对以上牙鲆发病地区进行了临床病症的调查，并进行了病原的分离和初步鉴定。     

环境因子对牙鲆精子运动能力的影响

于1997年5-6月,在山东荣成市石岛养殖场采用挤压法收集牙鲆亲鱼的精子,利用显微镜观察精子的活力,研究外界环境因子的变化对牙鲆精子运动能力的影响。结果表明,将蔗糖、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等溶解于去离子水中,制成不同浓度即具有不同渗透压的溶液,不同渗透压的溶液对精子运动的诱导结果不同。EDTANa2溶液不能诱导精子运动。在人工海水中加入一定量的EDTANa2后,可使原先运动的精子静止;在该溶液中加入新的Ca2 后,将不再诱导原来受到EDTANa2抑制的精子。如用MgSO4代替溶液中的CaCl2,可诱导精子运动;而当用MgCl2代替溶液中的CaCl2,以及用CaCl2或NaCl代替MgSO4时,溶液即失去诱导精子运动的能力。在pH＝4.0-9、5的海水中,牙解精子均可正常运动。