大菱鲆(Scophthalmus maximus)不同发育阶段视蛋白基因表达特征研究

视网膜视蛋白组成是动物识别光强与颜色视觉的基础,其会随着不同生长环境和发育阶段而发生变化。大菱鲆(Scophthalmus maximus)为重要的海水养殖鱼种,在发育过程中经历了从浮游生活到底栖生活的转变;生活习性的转变伴随着生存环境的变化,尤其是光照环境的变化。我们推测大菱鲆光照感知功能包括视蛋白种类及表达模式等,在不同阶段应有所不同,目前未见相关研究报道。本研究以1、4和9月龄大菱鲆为研究对象,通过qRT-PCR探查了不同阶段大菱鲆视蛋白基因表达的特征规律,通过分析三个发育阶段的视蛋白基因表达比例,推测鱼体光谱敏感性变化规律。结果表明,红视蛋白(LWS)基因表达量随鱼体发育逐渐降低,视紫红质(RH1)、紫外视蛋白(SWS1)和蓝视蛋白(SWS2)随鱼体发育表达量逐渐升高,而绿视蛋白(RH2)中高表达的RH2b1无显著变化。LWS表达比例由1月龄57.2%降至九月龄11.4%,RH2b1表达比例由1月龄29.9%升至九月龄73.3%。随着大菱鲆由早期浮游生活转入底栖生活,表达占主导地位的视蛋白,逐渐由LWS转变为RH2b1,其光谱敏感性可能由红色敏感向绿色敏感转变。大菱鲆视蛋白在不同发育阶段表达的特征变化引发的光谱敏感性变化,可认为是其对不同光环境的适应策略。     

饥饿和复投喂对大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ、mTOR、MyoD和MHC基因表达的影响

为从分子水平研究饥饿对大黄鱼肌肉生长代谢的影响，本实验采用qPCR技术研究了在饥饿胁迫以及复投喂过程中胰岛素样生长因子基因IGF-Ⅰ（insulin-like growth fator-Ⅰ）、雷帕霉素靶蛋白基因mTOR（mammalian target of rapamycin）、成肌分化抗原基因MyoD（myogenic differentiation antigen）和肌球蛋白重链基因MHC（myosin heavy chain）等4个大黄鱼肌肉生长调控相关基因在肝脏、脾脏、脑、心脏、肠、鳃、肌肉和肾8个组织中的表达模式。结果显示：四个基因在正常大黄鱼不同组织间表达存在显著差异；饥饿显著降低IGF-Ⅰ在肝组织中的表达量（P<0.05），在复投喂14d时显著上升，此外在肠和鳃组织中表达量变化显著（P<0.05）；mTOR表达量随着饥饿时间的延长，在脾、心和肾组织中表达量下降，在脑、鳃和肌肉组织中表达量显著升高（P<0.05）；MyoD在饥饿胁迫和恢复投喂期间，在肝脏、鳃和肌肉组织中表达量变化极显著（P<0.01）；饥饿和恢复投喂对MHC在鳃和肌肉中的表达影响显著（P<0.05）。结果提示饥饿可能通过调节这些肌肉生长相关基因的表达来影响肌肉的生长。     

蛋白质营养对工业化养殖大菱鲆生长、消化和免疫的效应

在封闭循环水养殖条件下, 选用体质量为(145.08±0.56)g 大菱鲆(Scophthatmus maximus L.)幼鱼,进行4 种蛋白质梯度水平(41%、46%、50%、55%, 即I、II、III、IV 组)的单因素试验74 d, 研究蛋白质营养对工业化养殖大菱鲆生长、消化酶、免疫机能的影响。结果表明: (1) 试验鱼增质量率随日粮蛋白质含量升高而提高, 中高蛋白水平(III、IV 组)增质量率分别极显著或显著高于I、II 组18.46%~65.75%,III、IV 组间无显著差异; 饲料系数则相应下降, III、IV 组分别极显著低于I 组21.15%~27.73%(P<0.01),II、III、IV 组间无显著差异;(2)大菱鲆胃肠、肝胰脏的蛋白酶活力随蛋白水平升高而显著增强, 其中IV组胃蛋白酶活力分别极显著高于其他组15.28%~31.96% (P<0.01), 肝胰脏胰蛋白酶活力分别显著或极显著高于其他组9.74%~26.29%; 胃肠淀粉酶、肝胰脏淀粉酶及脂肪酶活性受饲料蛋白水平影响不显著;(3)随日粮蛋白含量提高, 各试组鱼成活率与主要免疫器官溶菌酶活力呈先上升后缓降的趋势, III 组最优, 其成活率高于低、高蛋白水平组2.86%~9.34%, 但4 组间差异不显著; 肝脏溶菌酶活力分别极显著高于I 组80.07%(P< 0.01), 显著高于II 组43.56%(P< 0.05); 头肾溶菌酶活力极显著高于I、II 组67.78%和35.76%(P< 0.01); 与IV 组差异不显著;(4)血清ACP 及LYZ 活力随日粮蛋白水平提高先升后降, III组LYZ 活力极显著高于I 组31.92%(P< 0.01), 显著高于II 组18.72%(P< 0.05); 血MDA 随蛋白水平提高显著降低, IV 组分别极显著低于I、II、III 组13.26%~31.61%; 血清SOD 活力及C3 补体含量随日粮蛋白含量增加而提高, 但各组间差异不显著。结果表明, 日粮中、高蛋白质含量显著促进大菱鲆幼鱼的生长性能和蛋白质消化酶活力, 而中等蛋白水平更加有利于幼鱼重要免疫机能的发挥和成活率的提高。因而, 日粮中等蛋白质含量更适宜于工业化循环水养殖大菱鲆幼鱼的蛋白质营养和健康生长。     

三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）对大菱鲆（Scophthalmus maximus）免疫相关基因表达的影响

三（2-氯乙基）磷酸酯（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP）是一种新型内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs),低剂量就会造成很强的生物毒性。通过研究不同质量浓度梯度的TCEP对养殖大菱鲆的胁迫,发现其在24 h 、48 h 、72 h 和96 h的半致死浓度（LC₅₀）分别为190.76 mg/L、159.94 mg/L、140.70 mg/L和110.71 mg/L;安全浓度（SC）为33.60 mg/L。24 h内不同质量浓度梯度的TCEP和不同胁迫时间对养殖大菱鲆的影响表明,高于质量浓度33.60 mg/L的TCEP对大菱鲆具有急性毒性效应。用实时荧光定量PCR技术分析TCEP急性胁迫的养殖大菱鲆体内2种细胞免疫因子-组织相容性复合体alpha（MHC-Ⅱ α）和肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）的基因相对表达水平,发现经TCEP胁迫后2种细胞免疫因子的表达量都显著上调;随TCEP的质量浓度升高,特别是达到47.69 mg/L（$ \frac{1}{4} $ LC₅₀）以上时表达量的变化更加明显;而胁迫时间超过12 h,基因表达量会呈现先上升后下降的趋势,说明对大菱鲆免疫系统造成急性损伤。研究结果可为大菱鲆健康养殖提供参考,并为环境污染物检测提供分子标记参考。     

大菱鲆CD55负调控补体激活及其广谱细菌结合能力

CD55蛋白在哺乳动物中是一种补体调控因子,但其在鱼类中的功能未知。本研究探索了大菱鲆(Scophthalmus maximus) CD55(SmCD55)蛋白的功能。结果表明,SmCD55蛋白由344个氨基酸残基构成,含有一个N端信号肽和3个补体调控蛋白(CCP)功能域。SmCD55基因在大菱鲆多种组织中均有表达,其中,在肌肉中表达量最低,在脑组织的表达量最高。通过原核表达获得了重组的SmCD55(rSmCD55)蛋白,发现rSmCD55蛋白能够抑制大菱鲆血清的溶血活性和杀菌活性,表明其负调控补体系统的激活。此外,本研究还发现rSmCD55蛋白可以结合包括重要水产病原菌迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、鳗弧菌(Vibrio anguilla­rum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和海豚链球菌(Strep­tococcus iniae)在内的多种细菌,其中与哈维氏弧菌的结合能力最强。以上这些研究结果丰富了鱼类补体系统的理论知识,加深了对鱼类补体激活调控的了解。     

缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮关联SNP验证及相关基因NKA在氨氮胁迫下的表达特征分析

为筛查和验证缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮相关单核苷酸多态性(SNP)和基因, 为分子标记辅助育种提供参考, 通过竞争性等位基因特异性PCR (KASP)对位于缢蛏NKA基因(Sc-NKA)下游的SNP (g.21062868T＞A)进行验证, 采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测高氨氮胁迫下Sc-NKA基因的表达水平, 用免疫荧光技术对Sc-NKA蛋白进行组织细胞定位, 通过RNA干扰探究Sc-NKA基因在氨氮排泄中的作用。结果显示, SNP位点(g.21062868T＞A)与氨氮耐受性状显著相关(P＜0.05); Sc-NKA基因在氨氮胁迫后的mRNA和蛋白表达量均显著增加(P＜0.05); 缢蛏鳃中的柱状细胞和扁平细胞是Sc-NKA蛋白分泌的主要部位, 且在氨氮胁迫后细胞中的蛋白丰度增加; 干扰Sc-NKA基因6~48 h后, 缢蛏血淋巴中氨含量显著升高(P＜0.05),且Na⁺-K⁺-2Cl共转运蛋白1 (NKCC1)的mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。这些研究结果表明, Sc-NKA参与氨氮的排泄过程, 且与NKCC1在氨氮转运中具有协同作用。     

低盐胁迫下松江鲈aquaporin基因的表达变化规律

为了探究aquaporin基因家族成员在松江鲈(Trachidermus fasciatus)应对低盐胁迫过程中的调节作用，本研究选取7个Aquaporin基因（aqp1、aqp4、aqp7、aqp8、aqp10、aqp11和aqp12）为目标基因，利用实时荧光定量PCR技术检测了鳃、肠、肾和肝组织中7个基因在两种低盐胁迫处理下不同时间点(0 h、12 h、24 h和48 h)的表达水平。在两种低盐胁迫处理下，aqp4在松江鲈鳃、肝和肠组织中无表达，aqp7在鳃、肝组织中无表达。此外，其他aqp基因在四个组织中的表达量变化趋势具有显著差异。除肾组织中aqp12和肠组织中的aqp7、aqp8和aqp10之外，特定组织中aquaporin基因在两种低盐胁迫下呈现相似的表达量变化趋势。本研究通过比较分析了aquaporin基因在松江鲈应对不同低盐胁迫时表达变化规律的异同，相关结果为探讨这一家族成员在鱼类应激调节过程中的作用及洄游性鱼类适应盐度变化的分子调控机制提供了理论依据。     

眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris)发育中体色花纹时序发生的色素细胞变化和控制基因表达的分析I.胚胎时期

眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris)属于鲈形目、雀鲷科、双锯鱼属, 是热带珊瑚礁观赏鱼类的首选品种。不同体色和花纹与色素细胞相关基因的表达直接相关, 在其胚胎发育的过程中, 色素细胞的形态和数量一直在变化, 但不同发育时期各种色素细胞的动态变化及其控制基因表达情况等仍需明确研究。记录了眼斑双锯鱼胚胎时期色素细胞变化较为明显的6个发育时期, 观察了不同时期的体色及色素细胞的变化特点, 并利用荧光定量PCR检测了各发育时期的10个体色控制基因的表达情况。结果显示: 在胚胎发育阶段, 整个胚胎的颜色从橙黄逐渐转变为暗红、黑红、黑色到最终透明, 观察到卵黄囊表面幼体黑色素细胞到成体黑色素细胞的转变过程, 鱼体表面在翻转期出现成体黑色素细胞、在器官形成期出现红色素细胞, 眼睛及腹部在孵化期出现虹彩色素细胞。结合荧光定量PCR结果分析发现: 卵黄囊表面幼体黑色素细胞推测是外胚层中的神经嵴细胞直接发育而成, 不需要迁移过程; Ednrb、TYR、Tbx2b基因对幼体黑色素细胞的形成和发育有重要作用, Pax3、Dct、Aim1基因与成体黑色素细胞的分化、迁移、形成过程密切相关; 其中TYR基因的相对表达量在体节期出现显著增加, 说明TYR基因在胚胎发育初期就参与黑色素细胞的形成; Tbx2b基因不仅对黑色素细胞形成有影响, 对眼斑双锯鱼心脏的形成也有一定作用; Fms基因对红色素细胞形成有重要作用; Ltk基因的表达要早于虹彩色素细胞的出现; 相关性分析发现各基因之间存在相互作用。     

坛紫菜超氧化物歧化酶基因的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是植物细胞应对氧化胁迫的第一道,也是最重要的防线。本研究以坛紫菜转录组数据库中的unigene序列为基础,通过RACE扩增技术克隆得到了3条坛紫菜SOD基因的全长序列,分别命名为PhMSD,PhCSD1和PhCSD2。序列分析结果表明,PhMSD序列全长973 bp,可编码包含224个氨基酸,等电点为5.75的多肽序列;PhCSD1序列全长1029 bp,可编码包含134个氨基酸,等电点为4.65的多肽序列;PhCSD2序列全长954 bp,可编码包含216个氨基酸,等电点为10.74的多肽序列。根据保守序列和系统进化树分析,可以将三条PhSODs分成两个亚型:其中PhMSD属于锰超氧化物歧化酶,PhCSD1和PhCSD2属于铜锌超氧化物歧化酶。采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)测定了3条PhSOD基因在坛紫菜不同世代,高温胁迫不同时间水平以及不同失水胁迫梯度下的表达水平变化,结果表明:3条PhSOD基因在叶状体世代中的表达水平均显著高于丝状体世代;在不同水平的高温和失水胁迫下,PhCSD1和PhCSD2的表达水平显著上调,而PhMSD则表现出不同的表达模式,高温胁迫下被显著抑制,失水胁迫下没有发生显著变化。     

大菱鲆家系选育二代7种免疫因子的分析

为选育高成活率的大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)群体,对30个大菱鲆选育二代家系(F2)和1个普通养殖群体进行鳗弧菌攻毒实验(周期为14 d),统计分析死亡率。选取死亡率不同的6个选育家系和普通养殖群体构成7个实验组,采用半定量-聚合酶链反应(semi-quantitative polymerase Chain reaction,RT-PCR)技术对它们肝脏、脾脏、头肾的相关免疫因子——溶菌酶(Lysozyme)、抗菌肽(Hepcidin)、热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)、免疫球蛋白(Ig M)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin)的表达量开展研究,并应用SPSS 16.0软件对攻毒前后各免疫因子的表达量与攻毒后存活率之间的相关性进行分析。研究结果表明:攻毒前后选育家系幼鱼肝脏、脾脏、头肾中7个免疫因子的表达量普遍高于普通养殖幼鱼,且在7个实验组中,攻毒后的表达量相较攻毒前均呈现下降趋势;攻毒前,肝脏中lysozyme、Ig M的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01),HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表达量与存活率为显著性正相关(P0.05);脾脏中,Hepcidin、HSP70和HSP90的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01);头肾中,HSP70的表达量与存活率为显著正相关(P0.05)。综上,可以推断选育家系相对于普通养殖群体大菱鲆抗鳗弧菌性能更强,且7种免疫因子在鳗弧菌感染鱼体的过程中发挥重要的抗感染作用;从F2中获得一个抗鳗弧菌性能较强的家系(23号),可用于今后大菱鲆抗鳗弧菌品系的选育指导工作,为大菱鲆高成活率群体的选育提供参考资料和理论依据。     

光照和盐度对浒苔类胡萝卜素生物合成的影响

浒苔是一种在“绿潮”灾害中主要参与的绿藻。类胡萝卜素的生物合成是一种维持藻类正常生命活动非常重要的基本的萜类代谢活动。在本研究中，我们首次报告了浒苔2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径中所有基因的完整序列，这是浒苔中唯一的类胡萝卜素合成途径。随后，我们将这些基因序列与其他物种进行了比较。此外，通过检测三种不同的光照（1 000 lx，5 000 lx和12000 lx）和盐度（12‰，24‰和40‰）培养条件下的类胡萝卜素含量和参与此代谢的关键基因的表达水平差异，我们发现浒苔类胡萝卜素的合成可能受光照和盐度的影响，低光照和高盐度可以促进类胡萝卜素的合成。本研究结果表明：浒苔MEP途径和下游途径中涉及的基因可以在分子水平影响其类胡萝卜素的生物合成。本研究有助于更好地了解这些参与浒苔类胡萝卜素生物合成基因的作用以及环境对这些基因的调控。     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。     

免疫增强剂紫锥菊(Echinacea purpurea)提取物对大菱鲆(Scophthalmus maximus)头肾内非特异性免疫基因表达量的影响

通过给大菱鲆(Scophthalmus maximus)注射不同浓度的紫锥菊(Echinacea purpurea)提取物,测定其非特异性免疫指标的变化水平,研究其对大菱鲆的头肾内非特异性免疫分子基因相对表达量的影响,进而为其在大菱鲆养殖生产过程中推广应用提供科学依据。试验选取体重(250±20)g的大菱鲆作为试验动物,分别注射10、20、40mg/m L浓度的紫锥菊提取物,试验共进行28d,注射试验结束后,分别从高、中、低剂量组及空白对照组选出6尾大菱鲆,分别取出大菱鲆的头肾并提取总RNA。采用?Ct法进行目标基因的荧光定量分析,再应用SPSS17.0软件对获得的实验数据进行单因素方差分析。研究结果表明,紫锥菊提取物能够不同程度地提高大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因相对表达量。注射紫锥菊提取物28d后对大菱鲆头肾中Lysozyme基因相对表达量的影响显著(P0.05),对C3补体基因相对表达量的影响极显著(P0.01),对Transferrin基因相对表达量的影响显著(P0.05),对TGF-β1基因相对表达量的影响极显著(P0.01),对IL-1h基因相对表达量的影响极显著(P0.01),本试验研究表明,紫锥菊提取物能够显著提高大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因的相对表达量。     

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）tdh2基因和鳗弧菌（Kanguillarum）ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明...     

Rearing in intermediate salinity enhances immunity and disease-resistance of turbot (Scophthalmus maximus L.)

Studies were conducted to investigate the non-specific immune responses and disease-resistance of juvenile turbot Scophthalmus maximus,cultured at four different salinities(8,20,32 and 40) . Three concentrations(3.75 × 10 7,3.75 × 10 8 and 3.75 × 10 9 CFU/ml) of Vibrio anguillarum suspension were employed at each salinity to determine the 4-day LD 50 . The serum lysozyme activity,the alternative complement pathway activity(ACH50) and the phagocytosis percentage of head kidney in turbot were tested at 24,48 and 72 h post-challenge of V. anguillarum(1.1 × 10 8 CFU/ml,0.1 ml) ,respectively,to evaluate the non-specific immune responses at the selected rearing salinities. Fish reared at salinity 20 had the lowest mortality,namely,the highest 4-day LD 50 value(8.88 ± 0.17) . Besides,the lysozyme activity,ACH50 and the phagocytosis of turbot were the highest at the salinity 20,but with the lowest at the salinity 40 treatment regardless of sampling time. In addition,the non-specific immune activities kept increasing within 72 h post-challenge of V. anguillarum,except that the lysozyme activity increased from 24 to 48 h,and then decreased from 48 to 72 h at 40 significantly. These results together indicate that rearing in intermediate salinity(20) was able to enhance the immunity and disease-resistance of turbot.     

光色对豹纹鳃棘鲈幼鱼摄食、生长和存活的影响

为探究光色对鱼类摄食、生长和存活的影响,作者在模块化小型循环水养殖系统中,以豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)幼鱼(体长21.2 cm±1.22 cm,体质量112.46 g±2.632 g)为对象,设置5种光色环境(红、黄、绿、白和黑暗),进行了4个月的循环水养殖实验。结果表明:绿光下豹纹鳃棘鲈幼鱼摄食率高、饵料转化率高、饵料系数低,但不同光色下豹纹鳃棘鲈幼鱼的摄食不存在显著性差异(P0.05);幼鱼的体长增长,绿光组和红光组大,且与其余3组间差异显著(P0.05);幼鱼的体质量增长,绿光组最大,红光组和黑暗组次之,白光组和黄光组最小,且三者间差异显著(P0.05);各组幼鱼的肥满度并没有显著性差异(P0.05);除白光组幼鱼存活率(只有50%)最低外,其余各组幼鱼存活率均在80%以上,其中绿光组最高,为88.33%。可见,在循环水养殖生产中,绿光环境有利于豹纹鳃棘鲈幼鱼的摄食、生长和存活。