响应面法优化浒苔半纤维素的提取条件及其组分分析

以浒苔(Enteromorpha prolifera)为原料,采用响应面法优化碱性过氧化氢提取半纤维素的条件。在单因素实验的基础上,运用Box-Benhnken中心组合原理,设计四因素三水平实验,确定半纤维素最佳提取条件。采用红外光谱(FT-IR)和离子色谱(IC)分析浒苔半纤维素组分。结果表明,各因素对浒苔半纤维的提取率的影响为:时间温度料液比氢氧化钠浓度。碱性过氧化氢法提取半纤维素的最佳条件为:氢氧化钠浓度为4.8 g/L,提取温度为92℃,提取时间为5 h,料液比1︰70,半纤维素的提取率为56.75%,与预测值57.30%基本一致。FT-IR结果显示,浒苔半纤维素红外吸收光谱中含有明显的木糖和阿拉伯糖的特征吸收峰,为吡喃环结构,由β-糖苷键连接。离子色谱结果表明,浒苔半纤维素主要由木糖和阿拉伯糖组成,含有少量葡萄糖和半乳糖。木糖含量为54.4%,其次为阿拉伯糖,含量为15.3%,葡萄糖和半乳糖含量分别为5.6%和2.7%。     

氮磷营养盐对浒苔生长影响的初步探讨

在实验室条件下,设置不同的N、P浓度,研究单因子(P:30μmol/L,N:0～500μmol/L和N:500μmol/L,P:0～30μmol/L)对浒苔(Enteromorpha prolifera)生长的影响。结果表明:在高N、P浓度(N:500μmol/L,P:30μmol/L)条件下浒苔生长态势最好,具有较高的相对生长率(0.451)。添加N可以明显促进浒苔的生长,而且随着添加N浓度的提高促进作用增强,浒苔的相对生长率有较大幅度提高。添加P对浒苔的生长也具有一定的促进作用,但促进作用不如添加N的明显;随着添加P浓度的提高,浒苔的相对生长率提高幅度不大,这说明浒苔生长对N变化更为敏感。     

鲜浒苔稀硫酸水解产糖工艺研究

分别用质量分数为0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%的稀硫酸在121℃高温高压的条件下水解鲜浒苔30、60、90 min,浒苔水解残留物再用纤维素酶酶解,用DNS法测定上述各步骤中的还原糖产量。结果表明,浒苔总糖含量为67.2%。稀硫酸水解工艺中,硫酸质量分数为1.8%、水解90 min,浒苔还原糖转化率最高,达59.9%,每克干质量浒苔可产生447.0 mg还原糖。稀硫酸水解残留物纤维素酶酶解工艺中,浒苔还原糖转化率较低,在硫酸质量分数为0.6%、水解时间为60 min时还原糖转化率出现最大值,仅为6.5%。结果显示浒苔稀硫酸水解产还原糖效果显著,但并不能促进纤维素酶酶解。浒苔糖化可单独采用稀硫酸水解工艺,本实验条件下的最佳工艺条件为1.8%硫酸水解90 min。本研究探索了浒苔糖化工艺条件,对后续的浒苔燃料乙醇发酵研究具有一定的参考意义。     

两种海藻提取物抗水产动物病原菌活性的初步研究

研究了两种大型海藻——羊栖菜(Sargassum fusiforme)、条浒苔(Enteromorpha clathrata)提取物对11种水产动物病原菌的抑制活性。结果显示:羊栖菜乙醇粗提物乙酸乙酯相对溶藻弧菌(Vibrio algi-nolyticus)的抑制作用最明显,抑菌圈可达21.6 mm;薄层层析表明羊栖菜乙醇粗提取物乙酸乙酯相有6条层析带,其中Rf=0.54带对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最强,抑菌圈可达13.6 mm;条浒苔乙醚粗脂对11种水产动物病原菌均表现出了较强的抑制作用,其中对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最强,抑菌圈可达24.7 mm;进一步的实验显示,条浒苔乙醚粗脂3种洗脱组分抗菌性均比粗脂减弱了,而其95%乙醇洗脱组分对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可达13.8 mm。说明利用羊栖菜、条浒苔为开发海洋药物资源提供了可能。     

超声波辅助提取RP-HPLC法测定浒苔中的叶绿素a、b

建立了一种反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定浒苔(Enteromorpha prolifera)中叶绿素a和b含量。采用的色谱条件:Diamonsil-C18(4.6mm×150mm)柱,流动相为甲醇(含0.2%的乙酸)和丙酮,梯度洗脱,流速为0.8mL/min,进样量10μL,检测波长430nm。在此条件下,叶绿素a和叶绿素b与浒苔中的其他化合物分离良好,叶绿素a、b质量浓度为0.50～500mg/L具有良好的线性关系(R2=0.9999),能对浒苔提取液中的叶绿素a、b进行准确定量。     

浒苔发酵工艺优化及青蛤喂养效果评价

本试验以自然海区打捞上岸的浒苔(Enteromor phaprolifera)为原料,以植物乳酸杆菌为发酵菌种,发酵浒苔喂养青蛤(Cyclina sinensis)的特定生长率为响应值,确定浒苔发酵的最佳工艺。在单因素试验的基础上,以发酵时间、发酵温度、料液比为响应因素,以青蛤特定生长率为响应值,利用Box-Behnken中心组合方法进行三因素三水平试验设计,进行响应面分析。结果表明:影响浒苔发酵工艺的因素主次顺序为发酵温度、料液比和发酵时间,最佳发酵工艺条件为:发酵温度35℃,料液比(1∶1.5)g·mL^–1,发酵时间84h。通过测定发酵前后浒苔的常规营养成分,发现浒苔发酵产物的粗蛋白含量显著高于未发酵浒苔(P<0.05);使用工艺优化后的浒苔发酵产物所喂养的青蛤与投喂小球藻的青蛤在特定生长率与存活率方面无显著差异。本试验证明优化后的浒苔发酵工艺具有可靠性,其发酵产物具备成为青蛤养殖饲料的条件,为浒苔发酵饲料的开发利用提供理论依据的同时,也为贝类配合饲料的开发及应用提供极大参考价值。     

浒苔腐烂液的生物毒性及其对太平洋牡蛎胚胎发育的影响

为防范浒苔绿潮次生灾害和降低海水养殖风险,文章采用人工授精的太平洋牡蛎胚胎、不同相对浓度的浒苔腐烂液以及基于发光细菌的生物毒性检测法,通过实验分析浒苔腐烂液的生物毒性及其对太平洋牡蛎胚胎发育的影响。研究结果表明:随着浒苔腐烂液相对浓度的提高,太平洋牡蛎D形幼虫相对孵化率逐渐降低至0,滞育和畸形等非正常胚胎增多,囊胚-原肠期和担轮幼虫期占比降至极低,易发生卵膜破裂和卵裂球分散,这些与太平洋牡蛎胚胎发育的阶段特点和浒苔腐烂液生物毒性的作用机制等有关;浒苔腐烂液相对浓度(0.25～10g/L)与生物毒性呈显著正相关,生物毒性(10%～97%)与相对孵化率呈显著负相关,且生物毒性达重毒水平时(由56%至70%)相对孵化率大幅下降(由66%至18%);建议在太平洋牡蛎胚胎发育的相对孵化率为50%时发出浒苔绿潮的渔业高风险预警,对应的浒苔腐烂液相对浓度为4.6g/L、生物毒性为55%。     

2017年绿潮浒苔(Ulva prolifera)生理特征及孢子囊形成情况分析

近几年来在我国青岛海域连续暴发的浒苔绿潮造成了巨大的经济损失并且破坏了近海海洋生态系统平衡。因此,浒苔绿潮受到了越来越多的关注。本研究重点关注了绿潮暴发期间不同海域浒苔藻体生理特征和孢子囊形成情况。研究发现,不同海域里浒苔藻体生理特征差异显著,孢子囊比例显著不同,并且观察到漂浮浒苔的原位萌发。2017年5月中旬,我们在苏北浅滩紫菜养殖区域(33.78°N,121.29°E)对筏架绠绳上生长的绿藻,退潮后滩涂散落的绿藻和涨潮时海面上漂浮的绿藻进行为期5天的野外采集。另外,在2017年6月随科考船对浒苔暴发海域的浒苔样本进行采集。采集范围在(33.5°—36.5°N, 120°—124°E)。结果表明,从低纬度到高纬度,浒苔F_v/F_m(光系统Ⅱ最大光化学量子产量)值从0.65逐渐降低至0.3左右;YⅡ(光系统Ⅱ实时光化学量子产量)值也从最高0.5左右降低至最低0.1。此外,定生浒苔F_v/F_m值为0.6—0.8左右,明显高于漂浮浒苔; YⅡ值也有类似趋势。在孢子囊形成比例方面,定生浒苔约有5%藻体形成了孢子囊,而漂浮浒苔中孢子囊形成比例达到20%。数据表明,低纬度区域为浒苔来源地,浒苔生理活性良好,孢子囊形成比例低。随着浒苔往北漂移,其生理活性降低。并且,漂浮浒苔孢子囊形成比例显著性高于定生浒苔。本文认为,浒苔脱离来源区后,孢子囊的快速形成、成熟和孢子释放以及孢子的原位萌发是浒苔生物量激增的重要原因。     

双酶分步水解金枪鱼(Eleotridae)碎肉制备高F值酶解液的工艺研究

以金枪鱼碎肉为原料, 采用双酶分步水解法制备高F值酶解液, 通过Box-Behnken试验设计, 分别确定两步酶解的最佳条件, 酶解液经活性炭静态吸附去除游离芳香族氨基酸, 对脱芳后的酶解液进行氨基酸组成分析并测定F值。结果表明, 胃蛋白酶为第一步水解用酶, 酶解的最佳工艺条件为酶用量650U/g, 料水比1∶7(g/mL), 温度35.9℃; 风味蛋白酶为第二步水解用酶, 酶解的最佳工艺条件为酶用量50700U/g, pH 6.51, 温度51℃, 最终水解度达到36.87%±0.54%; 酶解液在pH 3.0, 温度35℃条件下, 经5%(质量体积分数)的活性炭吸附时间3h后, 脱芳率达到63.18%, F值为30.33, 符合高F值肽的要求。     

浒苔(Ulva prolifera)共附生细菌群落结构分析的引物优化

海藻共附生细菌密切参与宿主的生长发育、营养吸收等重要过程,浒苔(Ulva prolifera)是构成黄海绿潮的唯一优势种,对其共附生细菌开展群落结构分析,有望为成灾机制研究提供重要线索。由于植物叶绿体基因组同时具备原核特征和高拷贝数,会严重干扰共附生细菌基于16S rDNA的序列扩增。高等植物中开发了通用引物799F,利用其3′末端与植物同源区的非配对双碱基,可实现对细菌来源序列的特异性扩增。本文针对多个浒苔群体样本,首次评价了引物799F在藻类中的适用性,发现799F的3′末端与浒苔叶绿体同源区仅存在非配对单碱基,其扩增仍会受到浒苔叶绿体严重干扰。在引物799F的基础上,设计了新引物800F,与通用反向引物1492R配对扩增细菌16S rDNA中具高分辨率的V5-V9可变区,配合使用具热启动功能、同时不具校对功能的DNA聚合酶,可基本完全避免浒苔叶绿体来源序列的扩增,并阐明了方法的原理。优化的引物扩增方案可用于浒苔共附生细菌群落结构分析。     

苏北浅滩绿藻从定生到漂浮过程中的组成及其生长特性

本文研究了苏北浅滩紫菜养殖筏架上附生的定生绿藻及海面上的漂浮绿藻在3月底和5月初的群落组成及其演替变化。分别通过设置滩涂围隔实验和船基围隔实验,研究附着态和漂浮态绿藻和浒苔(Ulvaprolifera)的相对生长率,分析浒苔在苏北浅滩的实际生长状况以及滩涂潮水涨落对于浒苔成为优势种的影响,以期了解其暴发绿潮的原因。结果显示3月底定生绿藻群落主要以曲浒苔(U. flexuosa)和盘苔(Blidingia minima)为主要优势种,未见浒苔出现。5月初定生绿藻群落中主要以盘苔和扁浒苔(U.compressa)为优势种,其中浒苔只占15%。而在5月初海面漂浮的绿藻中,浒苔成为主要优势种,比例达到76%。在设置的船基围隔和滩涂围隔的生长实验中,均以5月初定生绿藻为初始生物量,其中附着态浒苔在转变为漂浮态浒苔过程中都获得了较高生长率,其平均相对生长率分别为53.0和64.2%/d,而漂浮态浒苔在船基围隔中获得相对生长率则较低,为19.1%/d。实验结果表明,定生绿藻中定生浒苔更快适应漂浮状态,可以通过高生长率迅速成为漂浮绿藻中的绝对优势种,为其暴发绿潮奠定生物量基础。     

紫菜养殖筏架上定生浒苔对黄海绿潮的贡献

Green tides caused by the unusual accumulation of high floating Ulva prolifera have occurred regularly in the Yellow Sea since 2007. The primary source of the Yellow Sea green tides is the attached algae on the Pyropia aquaculture rafts in the Subei Shoal. Ulva prolifera and Blidingia(Italic) sp. are the main species observed on Pyropia aquaculture rafts in the Subei Shoal. We found that U. prolifera has strong buoyancy and a rapid growth rate, which may explain why it is the dominant species of green tides that occur in the China's sea area of the Yellow Sea. The growth rate of floating U. prolifera was about 20%–31% d–1, which was much higher than Blidingia(Italic) sp. There were about 1.7 × 10~4 t of attached algae on the Pyropia aquaculture rafts in May 2012. We found that 39% of attached algae could float when the tide rose in the Subei Shoal, and U. prolifera accounted for 63% of the floating algae. Our analysis estimated that about 4 000 t of attached U. prolifera floated into the surrounding waters of the Subei Shoal during the recycling period of aquaculture rafts. These results suggest that the initial floating biomass of large-scale green tides in the Yellow Sea is determined by the U. prolifera biomass attached to Pyropia aquaculture rafts, further impacting the scale of the green tide.     

南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆

在10℃恒温培养条件下,从第29次南极科学考察获得的南极深海沉积物样品中分离筛选到产脂肪酶细菌3株,产脂肪酶真菌1株,对其进行分子生物学鉴定,确定为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas arctica）、芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）、Glaciecola sp.以及白冬孢酵母属（Leucosporidium sp.）.通过测定各酶的最适反应温度,获得产低温脂肪酶芽孢杆菌XZ18,该菌所产脂肪酶最适反应温度为30℃,在0℃仍有部分活性.从NaCl浓度和pH值2个条件对产酶条件进行研究,最终确定了该菌最适产酶NaCl浓度5.0%、最适产酶pH值为6,最高产酶量为4.65 U/cm3.通过PCR扩增,获得了脂肪酶全长序列,对该序列进行系统发育分析,发现该脂肪酶基因处于较独立的分支.     

黄海浒苔绿潮防灾减灾现状与早期防控展望

截至2019年，浒苔绿潮连续12年大规模暴发，对近海生态系统、沿岸环境与社会经济造成严重影响，已经成为黄海最严重的生态环境问题。本文总结了黄海浒苔绿潮防灾减灾现状与成效，分析了存在的问题，然后基于对该绿潮起源与成因的认识，将其早期分为3个关键过程，即浒苔微观繁殖体在养殖设施上的着生与生长过程，定生浒苔脱离附着基形成漂浮浒苔过程，浅滩漂浮浒苔进入深水区形成大面积绿潮过程。最后分别从加强新材料与技术研发防控绿藻着生、强化养殖设施回收管理严控定生绿藻落滩、浅滩汇聚通道拦截打捞等3种途径提出了早期防控措施建议，以期为黄海浒苔绿潮的源头防控提供科学依据。     

饲料添加发酵浒苔对花鲈(Lateolabrax japonicus) 生长性能、消化酶活性和免疫的影响

采用单因子试验设计方法, 配制发酵浒苔添加比例分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%的 6 种饲料, 探讨发酵浒苔对花鲈生长、体成分、胃、肠消化酶活性及血清、肝脏免疫的影响的研究。 将其饲喂初始平均体重为(6.40±0.14)g 的花鲈28d, 每组饲料设3 个重复, 每个重复投喂30 尾花鲈。 结果表明: (1) 随着发酵浒苔添加水平的升高各组花鲈增重率和特定生长率呈现先升高后降低的趋 势, 且差异性显著(P<0.05), 以2%组添加量最优。相比于对照组, 各添加组饲料系数均有下降。添加 发酵浒苔可适当降低鱼体中的水分, 提高灰分含量但并不显著(P>0.05).同时各添加组的粗脂肪和粗 蛋白含量均高于对照组, 各添加组之间并无显著性差异(P>0.05).(2) 在添加组中, 花鲈淀粉酶、脂 肪酶活性以及胰蛋白酶、胃蛋白酶活性均得到了显著提高(P<0.05).添加水平在2%-3%效果最好。 (3) 添加发酵浒苔可以显著提高血清超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性(P<0.05), 但对碱性磷酸酶的活 性差异不显著(P>0.05).本试验中肝脏超氧化物歧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶的活性均得到提高, 在 2%-3%组为最佳。     

春季西南黄海与绿潮相关的物理环境特征

Massive green tides caused by Ulva prolifera in the Yellow Sea have occurred every summer since 2007 and have caused huge economic losses for local governments. The Subei(North Jiangsu Province, China) Shoal, with its large-scale Porphyra aquaculture, has been regarded as the most important source of U. prolifera for green tides.To reveal the physical mechanisms of floating and drifting algae in this area, the characteristics of the current, the temperature, the salinity and suspended particulate matter(SPM) in the southwestern Yellow Sea, especially in the Subei Shoal, were studied. The topography of the radial sand ridges in the Subei Shoal constrains the features of the currents and causes net longitudinal and latitudinal movements. The longitudinal net movement is a dominant dynamic factor that can bring U. prolifera into offshore waters. The amount of gas that is produced by algae during photosynthesis determines whether U. prolifera can float well on the sea surface after it is disposed into the water from Porphyra aquacultural apparatus. The Subei Shoal is characterized by a high turbidity, which can result in significant light attenuation and affect the photosynthesis together with the buoyancy of a U.prolifera in the water. According to satellite remote sensing data from 2012, the three-month-averaged surface SPM(April, May and June) in the Subei Shoal was 140 mg/dm3, and the north of the Subei Shoal(the north of34.5°N), it was 11 mg/dm3. According to the monthly averaged surface SPM in April, the transparency in the Subei Shoal was only 0.1 m, but it often exceeded 2.0 m outside of the Subei Shoal. The results explain why the floating ability of U. prolifera increases significantly once the green algae drifted outside the Subei Shoal.     

浒苔光照和盐度胁迫响应基因UpMYB44的克隆与表达分析

为证明R2R3-MYB转录因子在浒苔响应非生物胁迫例如盐度和光照的过程中发挥的重要调控作用,利用实时荧光定量PCR、酵母双杂交系统、亚细胞定位等技术,研究获得了浒苔UpMYB44基因1 437 bp的开放阅读框(ORF)全长序列,编码478个氨基酸,属于典型的R2R3-MYB转录因子并通过烟草叶片转化确定其定位于细胞核,UpMYB44参与浒苔响应光照和盐度的胁迫过程,其中在低光和高盐胁迫下UpMYB44基因的相对表达量升高。筛选出了与UpMYB44互作的UpCPP5蛋白,该蛋白与浒苔的生长和细胞分裂有关,推测UpMYB44可能通过与UpCPP5互作,形成蛋白复合体参与浒苔的增殖过程。研究为日后深入探究MYB类转录因子家族调控藻类生长发育的过程奠定了基础,同时为研究浒苔快速繁殖的机制提供了思路。     

江苏近岸紫菜养殖筏架区定生绿藻群落结构及其受控因素

基于2010年10月至2011年4月对苏北紫菜养殖筏架区定生绿藻及环境因素调查数据,分析研究了紫菜筏架上定生绿藻种群结构和数量变化及重要环境因子对其的影响并估算了调查区绿藻总生物量.结果表明,筏架上定生绿藻种类有浒苔(Ulva prolifera)、盒管藻(Capsosiphon groenlandicus)、缘管浒苔(Ulva linza)、肠浒苔(Ulva intestinalis)、条浒苔(Ulva clathrata)和扁浒苔(Ulva compressa).绿藻生物量变化呈倒抛物线型,4月份为主高峰14898吨,11月份为次高峰2034吨,2月份最低,仅为729吨,3-4月份绿藻几乎呈暴发性增长.种类多样性随季节变化有很大差异,养殖筏架刚入海的9、10月份,绿藻种类丰富,生物多样性高;12月至笠年2月,尽管生物量很低,但仍是多种并存;3-4月份随着生物量的猛增,种类多样性降至最低,盒管藻优势地位明显,生物量比例最大能到80%,浒苔比例呈指数增长,达20%～40%.水温对绿藻生物量及种类演替有直接调控作用,在水温< 10℃时,绿藻即能快速生长;而盐度作用不明显.开展紫菜筏架上定生绿藻群落动态变化及其生物量的估算,为追溯南黄海大规模绿潮发源地提供佐证,为绿潮预防和治理提供基础数据支撑.     

抗生素对浒苔形态及共附生细菌多样性的影响

本文研究了3种抗生素联合处理黄海绿潮浒苔(Ulva prolifera)形态及共附生细菌多样性的影响。将浒苔放散的配子加入到含有3种广谱抗生素(青霉素G、硫酸新霉素、多黏菌素B)的培养液中进行培养, 与对照组相比, 发现浒苔幼苗生长速度缓慢, 且细胞变小, 藻体无法形成正常形态。进一步采用16S rDNA高通量测序分析抗生素处理藻体前后的共附生细菌多样性, 发现抗生素处理后浒苔共附生细菌丰富度和多样性降低, 其中Maribacter丰度降低。将藻体与形态发生化合物thallusin(Maribacter spp. 提取物)共培养, 发现thallusin可促进藻体形态恢复和生长, 推测抗生素可通过抑制Maribacter等细菌从而影响浒苔形态和生长, 这将为浒苔共附生细菌功能的深入研究奠定一定基础。     

不同氮磷比值下浒苔与石莼的竞争作用研究

近年来，海水富营养化导致近海海域大型海藻过量繁殖，成为世界性的环境问题。自2007年以来，浒苔绿潮在黄海海域连续暴发，造成巨大经济损失。为探究浒苔大规模暴发与氮磷比值(N/P)的关系，及其与其他大型绿藻在不同N/P下的竞争机制，研究了浒苔(Ulva prolifera)与石莼(Ulva lactuca)在不同N/P下单独培养和共培养时的生长情况，探究了浒苔及石莼生长的变化；结合苏北浅滩海域现场N/P的调查结果，分析了浒苔绿潮暴发的可能机制。研究结果表明:(1)浒苔单独培养时，在一定范围内高N/P能促进浒苔的生长，氮对于浒苔的影响大于磷。(2)石莼单独培养时，低N/P下石莼长势最好，但改变N/P对石莼的影响并不显著。(3)浒苔和石莼共培养时，浒苔生长受到了一定限制，低N/P下浒苔生长受限更显著。(4)苏北浅滩海域高N/P更适合浒苔的生长，可能是浒苔绿潮能够大规模暴发的原因之一。