分子鉴定方法研究大亚湾水体弧菌种类变化

借助分子鉴定方法监测大亚湾水体中弧菌Vibrio种类季节性动态的变化规律.通过增菌培养、菌株分离,在224份海水中共分离出弧菌368株,并用分子生物学辅助生化鉴定方法鉴定弧菌菌株.结果表明,在大亚湾海域水体中鉴定的弧菌种类有溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈氏弧菌V.harveyi和创伤弧菌V.vuinificus,没有检测到霍乱弧菌V.cholerae、拟态弧菌V.mimicus、河流弧菌V.fluvialis和霍利斯弧菌V.hollisae.溶藻弧菌和副溶血弧菌为优势菌群,分别占弧菌总数的27.99%和21.74%.     

广东沿海香港牡蛎消化道异养菌统计及其耐药性研究

本研究针对高温时期(6月、9月)广东沿海地区的香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内异养细菌总数和弧菌总数进行了深入的调查,并由添加单种抗生素(分别是:庆大霉素、呋喃唑酮、利福平、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素、复方新诺明)的培养基中分离得到310个菌株。进一步采用纸片扩散法(kirby-bauer法)针对常见的抗生素对此310个菌株进行药敏测试,了解不同来源菌株的耐药状况。结果表明310个菌株分属48个不同种属,主要是肠杆菌(Enterobacter)、弧菌(Vibrio)、芽孢杆菌(Bacillus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella)、希瓦氏菌(Shewanella)、不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、短波单胞菌(Brevundimonas)、发光杆菌(Photobacterium)、黄杆菌(Tenacibaculum)、盐单胞菌(Halomonas)等。在9月份从牡蛎体内分离的异养细菌比6月份分离的异养细菌高出1～2个数量级(除台山外)。6月份从台山地区牡蛎分离的异养细菌数(2.6×10~6～5.8×10~6 cfu/g)最多,高出其他地区1～3个数量级。药敏测试结果显示牡蛎体内异养细菌对20种抗生素普遍存在抗性,尤其对青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及万古霉素表现出较高的耐药率。高温时期(6月、9月)分离的异养菌大多数为多重耐药细菌,其比例分别为84.18%和91.72%。本研究将为牡蛎养殖业的疾病控制以及水产养殖中细菌的耐药状况提供重要参考依据。     

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

方斑东风螺肿吻症病原菌的分离鉴定及药敏分析

从海南省文昌县某养殖场患病方斑东风螺(Babylonia areolata)的吻、肌肉和肝脏中分离到2株优势菌。人工感染证实其中1株为致病菌,经形态学检测和生化鉴定,该病原菌为鳗弧菌生物变种Ⅰ(Vibrio anguillarum BiovarⅠ)。该病原菌对方斑东风螺的LD50值为1.7×10~6 cfu/g。药敏试验表明派拉西林、罗红霉素、红霉素、洁霉素、氟哌酸、先锋必、妥布霉素、菌必治、复方新诺明、利福平、复达欣、呋喃妥因等12种抗生素类药物对该病原菌敏感。     

褐点石斑鱼脱鳞病病原菌的分离与鉴定

从海南陵水新村港网箱养殖脱鳞病濒死褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)体内分离到3 株优势菌株XC08061、XC08062 和XC08063, 经回归感染试验确定为致病菌。这3 株细菌经生化鉴定以及16S rDNA 测序分析, 确定均为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。其中, XC08061 对体长为12～14 cm 褐点石斑鱼的半致死剂量为5.8×10² CFU/g 鱼体质量。药敏试验表明, 该菌具有较强的耐药性, 在所检测的25种抗菌药物中, 仅对新生霉素、头孢噻肟、先锋必/舒巴坦、诺氟沙星、依诺沙星和庆大霉素6 种抗菌药物敏感。     

中国对虾幼体致病菌哈维氏弧菌的分离及其生物学特性研究

于1996年4—5月,在青岛丰城地区一些对虾育苗场发生大规模爆发性传染病,主要感染中国对虾幼体,尤其是蚤状幼体。死亡率高达80％以上。从自然发病及人工感染患病濒死中国对虾幼体中分离出38株细菌,研究其形态特征,生理、生化特性及对中国对虾幼体的致病性。结果表明,38株分离物均为革兰氏阴性杆菌,菌体为杆状或短杆状,极生单鞭毛运动,不发光,氧化酶呈阳性,发酵葡萄糖产酸,TCBS平板上生长,菌落呈黄色或绿色,对弧菌抑制剂0／129（150g／ml）敏感,此均为弧菌属的典型特征,属于弧菌。其中26株细菌被归为同一类群,参照伯杰氏细菌学鉴定手册（1994年,第9版）鉴定表明,该菌同哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近;另外,Biolog系统鉴定表明也为哈维氏弧菌,因此定名为哈维氏弧菌。利用浸泡感染法以2．5×103—2.5×107cfu／ml浓度的细菌感染不同发育时期（无节幼体期、蚤状期、糠虾期和仔虾期）的中国对虾幼体。结果表明,该病原菌主要感染中国对虾幼体的无节幼体晚期、蚤状期和糠虾早期并导致其大量死亡,而在仔虾期感染死亡率较低,并且2．5×104cfu／ml以上浓度的病原菌即可导致蚤状幼体严重感染死亡,由此可见,所分离的致病菌对中国对虾蚤状期幼体具有较强的致病力。人工感染试验结果     

斜带石斑鱼烂尾病病原菌的分离与鉴定

2008年5月从海南省三亚红沙港与陵水新村湾网箱养殖的患"烂尾病"的斜带石斑鱼Epinephelus coioides中分离到3株优势菌株HS08001、HS08002和XC08001.人工感染试验表明,这3株菌株为斜带石斑鱼的致病菌.经菌株形态特征、培养特性和生理生化反应等表型测定以及16S rDNA测序分析,这3株细菌被鉴定为哈维氏弧菌Vibrio harveyi.其中,HS08001对斜带石斑鱼的半致死剂量为1.05×104CFU·g-1 鱼体重.药敏试验表明,该菌具有较强的耐药性,在所检测的25中抗菌药物中,仅对庆大霉素、氯霉素和利福平高度敏感,而对阿莫西林等18种抗菌药物不敏感.     

抗鲶爱德华氏菌多克隆抗体的制备及特性分析

利用2株黄颡鱼"红头病"病原菌——鲶爱德华氏菌的灭活疫苗作为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体特性进行了分析。测定获得多抗效价分别为1∶215和1∶214,2株病原菌之间存在很强的交叉反应,且2种多抗均与鲶爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、火神弧菌、河流弧菌、创伤弧菌标准菌株存在交叉反应,与粪肠球菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、海豚链球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、类产碱假单胞菌标准菌株均无交叉反应。免疫印迹实验结果表明,2株病原菌的主要抗原决定簇相同,分子量分别为61.1,46.6,41.3,28.8和19 kDa。本实验得到了黄颡鱼"红头病"致病菌高效价的多克隆抗体,可以作为初步筛选"红头病"病原菌的工具,为建立快速有效的疾病监测方法和进一步的免疫学防病研究提供了依据,奠定了基础。     

湖光岩拮抗菌的研究

采用涂布法、划线分离法以及形态学和生理生化特性分析，对湛江湖光岩微生物进行了分离纯化及部分性质研究；同时用平板菌落计数法对其异养细菌、真菌和弧菌等的数量进行初步统计。采用牛津杯法，对拮抗细菌进行筛选和培养特性研究。结果表明，微生物数量与种类在水平分布上具有显著差异。底泥异养菌总量为（1．3—8．6）×10^8 cfu／g，真菌总量为（0．1—5．7）×10^7 cfu／g。而水体细菌总量为（0．5—6．7）×10^5 cfu／ml，真菌总量为（0．4-1．1）×10^3 cfu／ml。共分离纯化到148株细菌，经筛选发现16株细菌对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）具有明显的抑制作用，占细菌总数的10．8％，其中菌株DH078和DH113对溶藻弧菌的拈抗作用最明显。结果还表明，细菌DH078在营养肉汤中培养4d抑菌活性最强，其产生抗菌活性物质的最佳条件是稀释2倍的营养肉汤、蛋白胨0．6％、牛肉膏0．6％、酵母膏0．2％、盐度0和pH7．0。可见湖光岩微生物资源较为丰富，本研究可为保护和充分开发利用湖光岩微生物提供科学依据。     

欧洲鳗病原菌控菌药物的研究

应用药敏纸片法测定２４种抗菌药物对欧洲鳗致病菌：非０１群霍乱弧菌、温和气单胞菌、鲁氏不动杆菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的敏感性。其中,诺氟沙星、四环素、头孢三嗪、庆大霉素、头孢噻肟抑菌能力较强。最低抑菌浓度（ＭＩＣ）和最低杀菌浓度（ＭＢＣ）测定结果表明孢三嗪对病原菌能力强。最低抑菌浓度（ＭＩＣ）和最低杀菌浓度（ＭＢＣ）测定结果表明,头孢三嗪对病原菌杀灭能力强,复方新诺明、硫酸庆大霉素对病原菌抑     

宁波-舟山港口航道3种致病性细菌毒力特征与耐药性

本文调查分析了宁波-舟山港口航道副溶血弧菌 Vibrio parahemolyticus、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila的毒力特征和耐药性特点。用PCR方法检测分离菌株的毒力基因分布模式发现,副溶血弧菌毒力基因型以gyrB⁺,toxR⁺,tlh⁺和 tdh⁺为代表,溶藻弧菌毒力基因型以aspA⁺,tlh⁺,collagenase⁺和toxS⁺为代表,嗜水气单胞菌毒力基因型以aerA⁺,alt⁺,aha1⁺和hlyA⁺为代表;副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌代表菌株相应基因的检出率分别为57.1%、40.0%和50.0%。用24种常见抗生素对3种细菌的分离代表菌株进行药敏调查,耐药率分别为4.17%、8.33%和29.17%。实验结果表明宁波-舟山港口航道3种致病性细菌具备较丰富的毒力基因种类和耐药性,需要有针对性地制定预防措施。此外,鉴于毒力基因型与致病性之间的相关性,毒力基因可作为标记基因,用于致病性细菌的检测。     

极地抗植物病原真菌活性菌株PKS和NRPS基因的克隆与分析

植物常见病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板扩散法对实验室保藏的38株极地细菌进行了抑菌活性验证,并对其中活性较强的菌株进行了分子鉴定与系统发育分析及次级代谢产物合成功能基因(PKS和NRPS)的克隆与分析。结果表明,38株极地细菌中,13株具有明显的抗病原真菌活性;分子鉴定与系统发育分析表明,11株活性菌株属于Pseudomonas,1株属于Psychrobacter,1株属于Arthrobacter;对活性菌株PKS和NRPS基因的克隆与分析表明,从10株活性菌株克隆到12条NRPS A结构域基因片段,其中5株活性菌株同时含有PKS I型KS结构域基因片段。据此为从聚酮和非核糖体肽等生物合成途径深入研究活性菌株的次级代谢产物提供了基因学证据。     

海洋微塑料作为生物载体的生态效应

随着海洋塑料垃圾的不断增多, 海洋微塑料作为一种新型的海洋污染物逐渐受到重视。目前关于微塑料来源分布及分析方法的认识较为普遍, 大部分研究注重于海洋生物误食微塑料、微塑料吸附及释放有毒物质的环境及生态效应, 而微塑料作为微生物、附生动植物的载体作用仍有待研究。文章综述了微塑料作为生物载体的三个作用: 1) 聚集作用。微塑料表面易覆盖生物膜形成微型生物群落, 为基因水平移动提供场所, 可能引发致病基因、抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, 简称ARGs)的转化、转导。2) 扩散作用。来源于污水的微塑料上可能附着生长着有害藻种、致病菌耐药菌或其他生物, 随水流移动到适宜区域, 可能引发赤潮或导致致病菌及耐药菌的传播扩散, 形成生物入侵。3) 首次提出微塑料的“捕食增强作用”概念, 即有机物、营养盐、生物群落聚集在微塑料颗粒上可提高捕食者的捕食效率, 从而促进海洋动物摄食微塑料, 进而加剧微塑料颗粒对海洋生物的毒理病理作用。文章着重阐述了“微塑料+生物”的生态效应。     

实验室海月水母大规模解体的初步研究

本实验针对两次突发的饲养海月水母(Aureliaaurita)大规模烂洞解体状况,通过对病灶处进行细菌培养,从其中每次发病水母中均各分离到2种优势病原菌菌株,利用PCR扩增和DNA测序技术,获得优势菌株16SrRNA基因序列,通过生物信息比对分析显示,导致两次海月水母发病的病原菌菌株分别为2种嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)和2种弧菌(Vibrio splendidusVibrio neptunius)。通过利用福林酚法进行此四种优势菌株的细菌发酵培养液蛋白酶活性的测定,结果显示,此4种细菌均具有较强的蛋白酶活性。根据实验结果推测,分离所得的2种嗜冷杆菌菌株(Paa1Paa2)和2种弧菌菌株(Vaa1Vaa2)作为此次发病海月水母的病原菌,有可能均是通过分泌胞外蛋白酶侵蚀水母伞体,从而导致伞体烂洞解体。通过本次实验分析,推测自然条件下水母暴发后的快速消亡是由水母自身免疫下降与细菌侵染的共同作用导致。     

南海珠江口TCBS和EMB类群细菌动态监测(1999~2002)

报道1999~2002年对南海珠江口(21°50'~22°50'N,113°20'~114°50'E)26个站点的动态监测结果:(1)TCBS类群包括37%Ⅰ类(假单胞菌属、气单胞菌属),5%Ⅱ类(副溶血弧菌)和58%Ⅲ类(霍乱弧菌、霍乱弧菌埃尔托型,溶藻弧菌);EMB类群包括14%Ⅳ类(变形菌属、沙门氏菌属或志贺氏菌属),50%Ⅴ类(肠杆菌属、克雷伯氏菌属、哈夫尼氏菌属、沙雷氏菌属)和36%Ⅵ类(大肠杆菌);(2)26个站点之间的年平均CFU值差异显著.各站点的TCBS类群数量多而EMB类群数量少,表明TCBS类群为土著优势,而EMB类群主要来自陆源性污染;(3)26个站点被聚类为四大类别,不完全吻合其实际地理位置邻近关系,提示人为干扰活动影响超越自然地理隔离效应.站点G(万山群岛)和H(担杆岛)同属最靠近外海的孤立站点,却被划分为不同类别.H站点TCBS类群数量最高(3.7±2.6×104CFU/cm3),G站点是天然养殖区,EMB类群数量最高(9.5±6.6×103CFU/cm3),表明养殖区域陆源性EMB类群污染突出;(4)TCBS与EMB类群的月平均CFU值变化趋势相似,呈现年度周期性和季节周期性波动;(5)珠江口可以分为南、北部区域.南部区域的陆源性EMB类群污染严重,综合反映了来自珠江口水网系的高通量排放污染,养殖区域的自身污染,及其养殖活动对陆源性污染菌群的规模化“原位扩增”效应.     

Studies on the edwardsiellosis and characterization of pathogenic bacteria from diseased flounder (Paralichthys olivaceus L.) and turbot (Scophthalmus maximus L.)

1IntroductionEdwardsiellahas been recognized as a world-wide-occurring pathogen of numerous marine fishspecies,and edwardsiellosis has been recorded in adiverse array of fish species,including chinooksalmonOncorhynchus tshawytschaL.(Amandi etal.,1982),cha…     

漂白粉消毒后对虾养殖源水细菌群落的响应特征研究

漂白粉消毒是凡纳滨对虾养殖源水常见的管控措施, 可有效控制病原菌传播; 然而,消毒会强烈扰动水体微生物群落,但源水细菌群落对漂白粉消毒的响应特征尚未阐明。在室内条件下, 设置高浓度(60 mg/L)和低浓度(20 mg/L)漂白粉消毒源水, 通过高通量测序及荧光定量PCR技术探究消毒后源水细菌群落、病原菌及抗生素抗性基因(ARGs)的动态响应规律。结果显示, 消毒后, 拟杆菌门(Bacteroidota)丰度上升, 高浓度组变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著降低; 至第3天, 两组源水的细菌群落组成趋于一致。此外, 漂白粉消毒显著改变了源水的细菌群落结构及共现网络的复杂性。在控制水体病原菌方面, 消毒后病原菌的总丰度降低, 但种类增加, 高浓度漂白粉消毒对病原菌的抑制作用更加显著。漂白粉消毒对ARGs的去除具有选择性, 仅对sul1、floR、cfr、tetQ有一定的去除作用, 且高、低浓度对ARGs的去除无差异。综上, 60 mg/L可以作为漂白粉消毒养殖源水的更好浓度选择。研究结果从微生物生态视角评价了不同浓度漂白粉的消毒作用, 可为对虾养殖生产中的源水管控提供理论支撑。     

一种新的牙鲆病原菌——兔莫拉氏菌

目前国内外已报道的牙鲆(Paralichthys olivaceus)细菌病的病原有鳗弧菌(Vibrio anguillarum)以及弧菌(Vibrio spp.)属的其他一些种类、爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、屈挠杆菌(Flexibacter maritimus)、肠球菌(Enterococcus seriolicida)、链球菌(Streptococcus spp.)、卡帕奇诺卡氏菌(Nocardia kampachi)、变异微球菌(Micrococcus varians)[1].     

海水中致病菌检测研究进展

海水中致病菌种类繁多、致病性强,对水产养殖和人体健康存在着潜在危害。传统的检测方法培养过程复杂繁琐、耗时长、效率低,难以满足实际工作的需求。因此,建立海水中致病菌的快速、灵敏、准确的检测技术势在必行。本文综述了流式细胞技术、分子生物学方法、免疫学方法和生物传感器技术等在海水致病菌检测中的应用,总结了上述方法在海水致病菌检测中的研究现状。