曼氏无针乌贼血细胞形态观察及吞噬性能的研究

用组织学和免疫学方法对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)的血细胞进行形态观察和免疫活性研究。根据血细胞大小和美兰染色结果,将曼氏无针乌贼的血细胞分为2类:较小的血细胞圆形,直径7.65~8.28μm,细胞核卵圆形,核质比约0.66,约占细胞总数的45.3%;较大的血细胞圆形,直径9.58~10.42μm,细胞核肾形,核质比约0.40,有些细胞具双核,约占细胞总数的54.7%。饥饿乌贼血细胞数量较正常乌贼有明显下降(t-检验,P<0.05),较大血细胞的比例有所上升,可达70%。细菌吞噬试验结果表明,较小血细胞对细菌无吞噬能力,而较大血细胞具有较强的细菌吞噬能力。饥饿组曼氏无针乌贼血细胞吞噬活力稍低,但并无显著差别(t-检验,P>0.05)。对曼氏无针乌贼血细胞形态和功能的研究,为探索曼氏无针乌贼免疫防御机理提供了基础资料。     

浙江近海曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni) 繁殖生物学特性变化研究

采用常规生物学方法和统计回归分析方法,对浙江近海曼氏无针乌贼的繁殖生物学特性进行了研究,比较了不同时期浙江近海曼氏无针乌贼卵巢成熟系数(GSI)、生物学体型及个体生殖力与生物学指标关系。结果表明,浙江近海曼氏无针乌贼GSI在4月份达到最高(9.51%±7.23%),相比20世纪60年代初、80年代初,自然海域曼氏无针乌贼的性腺发育提前,且生殖期延长。20世纪80年代初曼氏无针乌贼的生物学体型、怀卵量及个体生殖力均大于60年代初和自然海域曼氏无针乌贼,同时曼氏无针乌贼在人工养殖条件下生物学体型、怀卵量及个体生殖力增大。浙江近海曼氏无针乌贼的个体生殖力均随着胴长(ML)、体质量(W)、卵巢质量(WO)、GSI这些指标的增大而增大,除体质量相对生殖力(FW)与ML为密切正相关外,个体生殖力与这些指标的关系均达到了极显著水平(P<0.01)。多元线性逐步回归分析表明,WO是影响浙江近海曼氏无针乌贼个体生殖力的最重要指标。     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)繁殖期行为谱特征的研究

自然海域中曼氏无针乌贼产卵亲体性成熟提前和小型化现象明显，这可能是一种适应性进化，人工干预背景下曼氏无针乌贼繁殖期行为的动态变化值得关注。2020年4-6月室内采用聚焦个体扫描法和定点连续记录法分别观察和记录了曼氏无针乌贼繁殖期的行为活动，并按其生活习性和行为的生物学功能等进行系统化分类，构建了繁殖期行为谱。结果表明，曼氏无针乌贼繁殖期行为谱主要包括三大类12种行为：（1）游泳行为主要分为前进和后退，繁殖期的雌性多处于静潜水底或静浮水中的状态；（2）捕食行为主要分为发现、定位、捕捉和咀嚼等系列动作，曼氏无针乌贼能够快速感知周围17.0-36.0 cm范围内的饵料，捕捉的有效距离为8.0-22.0 cm，能在2.0-10.0 s内完成对饵料的高效捕获；（3）繁殖行为复杂，主要分为求偶、伴游、交配、产卵等，其中求偶行为体现在雄性对雌性的自我展示、追逐配对和争斗护卫等过程，雄性在争斗护卫和伴游过程中的护雌行为尤为激烈。曼氏无针乌贼交配时采用"头对头"的方式，平均交配持续时间42.9 s。曼氏无针乌贼对产卵附着基有选择性且偏好于最初的附卵物，卵群对雌性产卵行为有诱导和刺激作用，每次产卵到附卵过程平均用时108.6 s。曼氏无针乌贼繁殖期行为谱特征的研究可为后续曼氏无针乌贼行为机制和基于全生活史的资源保护等方面提供理论依据。     

胶州湾及邻近水域曼氏无针乌贼的生长和季节分布

报告了胶州湾及邻近水域曼氏无针乌贼的生长和季节分布的调查结果。所用材料为１９８０年８月－１９８１年７月渔业资源调查所获得的资料。曼氏无针乌贼是５月上旬进入胶州湾生殖洄游，乌贼在胶州湾生长很快，８，９月间日增长量可达１．１３ｍｍ。整个胶州湾均为曼氏无针乌贼的产物卵场。１１月曼氏无针乌贼离开胶州湾，开始越冬洄游。     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)野生及养殖群体的生化特征及其形成机制的研究

采用生化测定法,对野生及养殖曼氏无针乌贼肌肉的生化特征进行研究,并对其可能的产生机制进行探讨。结果表明,就常规生化组分而言,野生与养殖曼氏无针乌贼碳水化合物和粗脂肪含量并无显著差异(P>0.05);而在水分、粗蛋白等含量上则有显著差别(P<0.05),养殖群体含有较高的蛋白和较低的水分含量。就氨基酸组成而言,野生与养殖曼氏无针乌贼均含18种主要氨基酸,但在含量上养殖群体绝大多数氨基酸均显著高于野生群体(P<0.05)。在脂肪酸组成上,养殖群体较野生群体少一种脂肪酸(十五碳酸C15:0),而在含量上绝大部分脂肪酸与野生群体无显著差别(P>0.05)。该结果说明现阶段的人工驯养并未使曼氏无针乌贼品质下降,养殖群体完全可代替野生群体,成为人类理想的保健食品。养殖群体部分生化指标的变化可能与人工驯养条件下的饵料组成的优质化和单一化及生活环境的改变有关。     

人工养殖曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖生物学特性研究

采用常规生物学方法和统计回归分析,研究了养殖曼氏无针乌贼卵巢成熟系数(GSI)的变化规律和个体生殖力与其主要形态指标之间的相互关系.结果表明,曼氏无针乌贼春苗100日龄时GS/达到最高(12.2%±3.25%),秋苗140日龄时GSI达到最高(13.7%±3.69%).曼氏无针乌贼秋苗的体质量相对生殖力(F<,W>)极...     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)ALSM基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术分离、克隆得到曼氏无针乌贼肝脏ALSM(Astacin-like squid metalloprotease)基因。序列分析表明,ALSM cDNA序列全长1418bp,其包括53bp的5’端非翻译区,1290bp阅读框以及含有poly(A)信号AATAAA的75bp3’端非翻译区,阅读框编码429个氨基酸残基。推导蛋白的相对分子质量为48916.31Da,等电点为7.978。ALSM氨基酸序列的同源性分析显示,不同进化地位动物的ALSM氨基酸序列都具有较高的同源性。系统发生树分析发现,曼氏无针乌贼ALSM首先与金乌贼、莱氏拟乌贼、长枪乌贼及太平洋褶柔鱼的ALSM-Ⅰ亚型聚类,再与其ALSM-Ⅱ及ALSM-Ⅲ亚型聚类。生物信息学分析表明,ALSM编码的蛋白为一种亲水性的分泌蛋白。这些结果对进一步研究ALSM的结构与功能以及从基因调控角度探索曼氏无针乌贼在养殖条件下生物学特性变化机理具有重要意义。     

光照周期对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)繁殖、性类固醇激素系统及生长性能的调控作用

养殖条件下的性早熟、个体小型化是影响曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)的养殖效益的重要因素。为探讨养殖条件下曼氏无针乌贼性早熟的可能因素,本文探讨了3种不同光照周期(23D:1L;12D:12L;1D:23L)对其繁殖性能及个体生长的影响。结果表明:光照周期对曼氏无针乌贼的繁殖性能总体影响不大,除长光照周期(1D:23L)下,睾酮(T)、雌二醇(E2)等激素水平有较显著的降低外(P0.05),光照对乌贼繁殖时间、性腺重及性腺发育指数等指标均无明显影响。但光照周期对曼氏无针乌贼生长却有明显影响,在胴长、体重、瞬时生长率(IGR)及肥满度等生长指标上均呈现出短光照组中光照组长光照的趋势。短光照组雌乌贼在体重、瞬时生长率和肥满度,雄乌贼在胴长等指标上,均显著优于长光照组(P0.05)。该结果表明光照周期可作为影响曼氏无针乌贼生长性能的重要因素,在今后的养殖条件优化中应加以考虑。     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)精子表面蛋白17(Sp17)基因克隆以及组织表达特异性分析

精子表面蛋白17(Sp17)是参与受精过程的关键分子。本研究采用RT-PCR以及RACE技术克隆得到了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Sp17简称Sj-Sp17 c DNA的全长序列,序列全长1463bp,5′和3′非编码区分别为92bp和222bp,预测的开放阅读框(ORF)全长1149bp。编码的蛋白理论分子量为42.0548k Da,等电点4.66,是一种亲水性蛋白,不存在跨膜区以及信号肽序列,含有丰富的螺旋结构(54%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他软体动物的相似性最高仅为44%,表明Sp17在进化中并不保守。基于Sp17氨基酸序列构建的系统进化分析表明,曼氏无针乌贼和加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)进化关系最近。组织特异性分析发现Sp17在曼氏无针乌贼的生殖系统中均有较高的表达量,其中在精巢和储精囊中有显著表达。Sp17基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于深入研究其细胞定位以及生物学功能具有重要意义。     

基于数学模拟研究曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)在不同温度下进食后胃内容物特性变化及胃排空规律

为研究曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)在不同温度下(15oC、20oC和25oC)进食冰鲜葛氏长臂虾(Palaemon gravieri)后的胃内容物特性变化及胃排空规律,本实验将采用3种常用数学模型(线性、平方根及指数模型)对胃排空曲线进行拟合,比较进食后胃排空过程中胃内容物的水分、pH和消化酶的变化规律。结果表明,3种数学模型均能较好地描述曼氏无针乌贼胃排空曲线,但是平方根模型对曼氏无针乌贼胃内容物湿重和干重的数据拟合效果最优。根据平方根模型计算,在15oC、20oC和25oC水温时曼氏无针乌贼50%胃内容干重排出的理论时间分别为4.4h、3.7h和3.6h,而完全排空的时间分别为13.8h、12h和12h。在摄食后0—14h内,胃内容物水分含量表现为先逐渐下降后显著上升;pH值在摄食后0—8h内逐渐降低,8—14h缓慢上升;胃蛋白酶和胰蛋白酶均呈现先升高后降低的变化趋势,而淀粉酶则总体保持恒定。曼氏无针乌贼在15oC、20oC和25oC三个温度下进食冰鲜葛氏长臂虾,胃排空过程中的胃内容物水分含量、pH值和消化酶比活力均存在显著差异(P0.05)。综上所述,25oC水温条件更有利于曼氏无针乌贼的胃排空过程,同时建议在饲喂管理中按照3.6h的间隔进行投喂。     

青蛤(Cyclina sinensis)cDNA文库构建及免疫相关因子基因的筛选

在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础.     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)漆酶型酚氧化酶的纯化及特性分析

采用非变性电泳结合特异性底物发色方法从菲律宾蛤仔血细胞中分离出一种酚氧化酶,研究了该酶的酶促反应动力学参数,金属离子、抑制剂对酶活的影响。结果表明,分离获得的酚氧化酶分子量约为563kDa;对底物邻苯二酚、左旋多巴(L-DOPA)、多巴胺、对苯二酚的米氏常数Km分别为0.42、1.60、1.79和1.76mmol/L;酶的活性在Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Ca2+浓度为5、10、20、30mmol/L时受到抑制;酶的活性可被抑制剂抗坏血酸、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DETC)、半胱氨酸、亚硫酸钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、叠氮钠和硫代尿素等抑制。根据底物特异性、抑制剂等结果,所分离获得的酚氧化酶属于漆酶型的含铜酚氧化酶。     

青蛤(Cyclina sinensis)溶菌酶基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达

利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

虎斑乌贼(Sepia pharaonis)FMRFamide G蛋白偶联受体基因的克隆与表达定位研究

以FMRFamide为典型代表的FMRFamide相关肽,是目前已知的最大的神经肽家族。FMRFamide广泛参与多种生理过程,包括摄食、心跳、渗透平衡、变态、防御和免疫等。采用同源克隆法与RACE技术获得了虎斑乌贼FMRFamide的G蛋白偶联受体基因cDNA全长序列(命名为SpFaGPCR,OL765295),SpFaGPCR cDNA全长1514bp,包括222bp的5''-非编码区(5''-UTR)、35 bp的3''-UTR以及1257bp的开放阅读框(ORF),共编码418个氨基酸。预测相对分子量(MW)为49.8kDa,等电点(pI)为9.76,具有7个跨膜结构域、糖基化位点7个、磷酸化位点36个。同源序列比对分析表明,SpFaGPCR与曼氏无针乌贼的FaGPCR氨基酸序列相似度最高达98%。系统发育分析显示SpFaGPCR与双壳纲的FaGPCR聚为姐妹支。荧光定量结果显示SpFaGPCR在视叶、视腺、脑、缠卵腺中表达量相对较高(P<0.05)。进一步利用原位杂交技术检测到虎斑乌贼视叶的髓质区、视网膜的感光细胞和缠卵腺的瓣叶外层具有明显的阳性杂交信号。实验结果为进一步探讨FMRFamide通过FaGPCR的介导参与虎斑乌贼生理代谢功能奠定了前期基础。     

三斑石斑鱼(Epinephelus trimaculatus)两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性

通过设计引物,从三斑石斑鱼的卵巢中克隆鉴定出性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的cDNA序列,EtP450arom a开放阅读框为1557bp,编码519个氨基酸残基;EtP450arom b开放阅读框为1530bp,共编码510个氨基酸残基;性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的氨基酸序列的同源性为63.3%,并且包含了芳香化酶经典的功能保守结构。构建了芳香化酶的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法研究了性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)在雌性成鱼各组织中的mRNA的表达情况。组织表达结果显示,性腺芳香化酶EtP450arom a只在性腺中特异性表达,而脑芳香化酶EtP450arom b主要在脑区和垂体中表达,表明三斑石斑鱼两种芳香化酶基因的组织特异性及功能的差异。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究

通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。     

三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析

为了研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)HMGR基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:KF280756)。该序列全长2575bp,包括一个53bp的5′端非编码区,一个686bp的3′端非编码区和一个长度为1836bp的开放阅读框,编码611个氨基酸。该氨基酸序列与已公布的美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列相比一致性达65%,具有Ⅰ型HMGR保守催化区域、两个HMG-Co A结合基序和两个NADP(H)结合基序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析三疣梭子蟹HMGR基因的组织差异表达及在蜕皮周期中的表达水平变化,结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹大颚器(MO)中的表达量最高,在其它组织中表达量均极低;在三疣梭子蟹蜕皮周期中,大颚器中HMGR基因的表达量自A期至D0亚期升至最高,然后下降,至D4亚期最低。验证了大颚器是三疣梭子蟹合成甲基法尼酯的唯一器官,表明HMGR在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要作用。     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。