异源精子诱导栉孔扇（Chlamys farreri）雌核发育二倍体早期胚胎的细胞学研究及GISH鉴定

采用紫外线遗传失活的太平洋牡蛎精子作激活源，经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝第二极体抑制型雌核发育二倍体；运用石蜡切片显微技术，对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察；采用荧光原位杂交（GISH）技术对担轮幼虫期胚胎进行检测。结果显示，紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀，形成雄性原核，但不形成染色体，而是浓缩为致密的染色质小体（DCB），DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中，不与雌原核融合；GISH检测结果显示，在早期胚胎中没有检测到外源太平洋牡蛎精子的遗传物质。实验结果可为研究异精诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体提供细胞学依据。     

人工诱导栉孔扇贝雌核发育胚胎的SNP标记分析

利用紫外线照射灭活的同源精子,激活栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子分裂,获得雌核发育胚胎,流式细胞仪检测胚胎细胞平均单倍体率为82.5%。对获得的胚胎进行全基因组扩增,获得足量的基因分型模板,利用高分辨率溶解曲线(HRM)技术对其进行96个单核苷酸多态性(SNP)位点分型。结果显示,诱导雌核发育胚胎的位点检出率为96.27%,其中99.06%的位点分型结果与相应雌性亲本相符;单个胚胎中只表现一种等位形式的位点占91.67%~96.88%,平均为94.81%,较雌性亲本的纯合位点比例(64.25%)明显提高。本研究利用灭活同源精子诱导获得栉孔扇贝雌核发育胚胎,并利用单个胚胎的全基因组扩增产物进行基因位点分析,为扇贝人工诱导雌核发育个体的早期多基因位点检测和评价提供参考。     

栉孔扇贝雌核发育二倍体早期成活与生长发育的研究

利用筛选出的精子遗传失活法和卵染色体加倍法,批量诱导出第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体个体,观测了幼体不同发育时期的成活率、发育速度和个体大小等生物学特性。结果发现,雌核发育二倍体的卵裂率、胚胎畸形率、D形幼虫发生率、孵化后3,6,9,12,15,18 d的成活率均显著低于对照组,表明栉孔扇贝基因组中可能存在大量有害隐性基因,雌核发育个体中有害隐性基因的纯合导致了成活率的显著下降。在发育速度方面,D形幼虫期之前,雌核发育二倍体个体明显低于对照组个体;壳顶期后则相反,雌核发育二倍体个体高于对照组个体。在个体大小方面,雌核发育二倍体个体在孵化后3 d前,壳长和壳高均小于对照组个体;孵化3 d后,壳长和壳高逐渐大于对照组个体。这一结果显示随着致死隐性基因因纯合而被自然排除,雌核发育二倍体的生长性状逐渐优越于正常个体,通过将这些雌核发育二倍体个体培养至成体,则可望培育出栉孔扇贝的优良品系。     

栉江珧第1卵裂抑制型雌核发育二倍体人工诱导的研究

利用6-二甲基氨基嘌呤(60 mg/L;6-DMAP)抑制第一卵裂,成功诱导出栉江珧(Atrina pectinata)雌核发育二倍体.研究结果表明在培养温度为24℃的条件下,受精后60 min用质量浓度为60 mg/L的6-DMAP处理栉江珧受精卵15 min进行雌核发育二倍体的诱导效果理想,D形幼虫发生率和诱导率分别为14.7%和22.7%.细胞学观察显示,6-DMAP阻止了纺锤体的形成和染色体的移动,导致一个融合的二倍性雌性原核的形成.本研究结果首次提供了栉江珧雌核发育二倍体的细胞学证据.     

栉孔扇贝♀×华贵栉孔扇贝♂受精及早期胚胎发育过程的细胞学荧光显微观察

为探讨贝类杂交优势 ,利用HOECHST3 3 2 5 8对已固定样品进行染色的方法 ,连续观察了栉孔扇贝♀×华贵栉孔扇贝♂受精的细胞生物学过程 ,初步证明了这 2种远缘扇贝种类之间进行杂交的可行性。结果表明 ,栉孔扇贝的成熟未受精卵子处于第一次减数分裂中前期 ,部分来自华贵栉孔扇贝的异源精子可顺利进入卵子并激发后者完成 2次减数分裂 ,排出第一及第二极体。成熟的雌雄原核形成后完成融合过程 ,形成合子核 ,受精过程结束。大部分杂交受精卵及杂种早期胚胎可以正常发育 ,但其发育进程较种内近交对照组有明显的差别 ,具体表现在延缓性和不同步性 2个方面。     

四种滤食性贝类滤食器官鳃的扫描电镜观察

利用扫描电子显微镜技术对海湾扇贝、栉孔扇贝、太平洋牡蛎、菲律宾蛤仔４种滤食性养殖贝类的滤食器官鳃的形态结构进行了观察和比较。结果表明：１、４种贝类的鳃纤毛是极其发达的,鳃丝内侧分布大量的粘液细胞;２、海湾扇贝、栉孔扇贝鳃丝的侧纤毛不如太平洋牡蛎和菲律宾蛤仔的发达,太平洋牡蛎鳃丝内侧纤毛很发达;３、４种贝类鳃丝之间的距离都大于２０μｍ,鳃丝间距排序为菲律宾蛤仔＜海湾扇贝＜栉孔扇贝＜太平洋牡蛎。从电镜观察的结果看,贝类的取食与鳃的结构及鳃丝上纤毛的运动密切相关。     

电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的相关参数的筛选

电刺激可诱导卵子雌核发育,但在海洋生物中尚无报道。为获得电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的最佳条件,采用正交设计的方法,分别研究了电场强度、电容、脉冲次数、卵子密度及缓冲液种类对诱导效果的影响。结果表明:(1)不同缓冲液的诱导效果差异不显著(P>0.05),但甘露醇缓冲液的诱导效果优于Zimmerman氏缓冲液和山梨醇缓冲液;最佳卵子密度为11.25×104个/mL,场强的最适范围为1.00～1.75kV/cm。最优电刺激诱导条件组合是:0.30mol/L甘露醇缓冲液,卵子密度11.25×104个/mL,脉冲强度1.20kV/cm,电容3μF,2次电脉冲。(2)应用优化后的电刺激参数诱导雌核发育,获得了最佳的诱导效果,得到的卵裂率为28.16%,胚胎存活率为98.37%。本研究首次成功应用电刺激法诱导了栉孔扇贝的雌核发育,并得到了单倍体胚胎,初步建立了栉孔扇贝中该诱导法的参数体系。     

刺参雌核发育二倍体的诱导及其早期生长发育

紫外线照射使精子遗传物质失活,用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放,诱导刺参(Apostichopusjaponicus)雌核发育二倍体。用强度为2561μW/(cm2.s)的紫外线(254 nm)照射不同时间的精子与正常卵子受精。结果发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼虫发生率逐渐降低,照射30 s时小耳幼虫发生率降为0。受精后35 min,显微镜下观察到有20%~30%受精卵排出第1极体时,用浓度0.5μg/mL的CB持续处理受精卵20 min,诱导出刺参第二极体抑制型雌核发育二倍体,雌核发育二倍体发育速度低于正常二倍体。微卫星分析表明,雌核发育二倍体诱导成功率为93.3%。     

人工诱导香港巨牡蛎雌核发育单倍体的研究

研究利用紫外线诱导香港巨牡蛎Crassostrea hongkongensis雌核发育的条件.结果表明,在强度为1820μW · (cm2·s)-1的紫外线(254nm)下分别照射精子0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,70,80和90s后,照射30s的实验组能够保持较高的受精率(61.6%),该组的D形幼虫发生率为0,出现"Hertwig效应".研究表明,在强度为1 820 μW·(cm2·s)-1的紫外线下照射精子30s是获得香港巨牡蛎雌核发育单倍体的适宜条件.研究还表明受精率和D形幼虫发生率随照射时间的增加而下降,遗传失活的精子与正常卵子受精后其胚胎发育至D形幼虫前期停止.经紫外线照射的精子授精后所产生的单倍体胚胎发育速度慢于正常受精所产生的二倍体胚胎,各照射组均出现非整倍体.     

栉孔扇贝第1卵裂抑制型雌核发育二倍体的研究

利用6-二甲基氨基嘌呤(60μg/cm3;6-DMAP)和细胞松弛素B(0.5μg/cm3;CB)抑制受精卵的第1次卵裂,授精后60和65 min分别用CB和6-DMAP持续处理20和15 min,可诱导出12.5%和27.5%的第1卵裂抑制型雌核发育二倍体.细胞学观察显示,6-DMAP抑制第1次卵裂产生的雌核发育二倍体主要在第1次有丝分裂后期的受精卵,由于破坏了纺锤体和阻止了染色体分离,导致一个二倍性雌核的形成,而CB有效地阻止了第1次卵裂的胞质分裂.尽管倍化率和D型幼虫发生率较低,但该研究首次报道了栉孔扇贝第1卵裂抑制型雌核发育二倍体诱导的可行性.