基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化

【目的】筛选可促进海洋真菌产生代谢产物更丰富的发酵条件,进一步挖掘菌株在抗阿尔茨海默症方面的潜力。【方法】基于OSMAC策略,分别选用马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基、察氏培养基、大米培养基和葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(GPY)培养基,并设置3种盐度(3、30和100),对Talaromyces sp. 001、Penicillium sp. 019和Aspergillus terreus ZN4-5-4等3株海洋真菌进行小规模发酵培养。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据TLC指纹图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段筛选出代谢产物丰富、毒性小且AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富的发酵培养条件。【结果】菌株001的最优发酵条件是盐度3的GPY培养基,菌株019的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基,菌株ZN4-5-4的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基。【结论】OSMAC策略指导下,改变培养基条件对菌株产生次生代谢产物有显著影响。     

盐酸普鲁卡因诱导下海洋真菌Hypocrea lixii次级代谢化学成分

【目的】通过化学诱导方法从一株海洋真菌Hypocrea lixii中获得多样化的活性小分子化合物。【方法】对菌株在盐酸普鲁卡因的化学诱导作用下进行固体发酵,代谢产物采用硅胶减压柱层析、Sephadex LH-20以及pHPLC等手段分离纯化,对化合物运用NMR、MS等波谱学技术并比对文献进行结构鉴定,采用Ellman比色法及DPPH自由基清除法对化合物进行初步抗乙酰胆碱酯酶(AChE)和抗氧化活性测试。【结果】从海洋真菌Hypocrea lixii在盐酸普鲁卡因诱导下的发酵提取物中分离得到4个异黄酮类化合物,包括6'-O-crotonylgenistin(1)、Genistein(2)、Daidzein(3)和Genistin(4),以及对氨基苯甲酸甲酯(5)、对羟基苯丙酸(6)和胞嘧啶(7),其中化合物1和6为该种中首次报道,化合物5为生物转化来源首次报道,化合物2~4可能源自培养基。在100μmol/L剂量浓度下,化合物1~4对AChE的抑制以及DPPH自由基的清除活性均较弱,化合物5和6显示了相对强的AChE抑制活性,抑制率分别为40%和38%。【结论】盐酸普鲁卡因对该菌次级代谢产生了显著的影响,为深入研究该菌株化学诱导次级代谢产物提供基础。     

海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的分离及多样性分析

【目的】分析海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的多样性,并对活性菌株胞外与胞内代谢物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力进行测定。【方法】采用溶钙圈分离培养技术和DPPH自由基清除法,从湛江海域6种海洋动物肠道中分离活性乳酸;通过构建16S rDNA基因序列系统发育树,分析其多样性;利用DPPH自由基清除法,测定其抗氧化活性。【结果】共分离得到16株抗氧化活性乳酸菌,分属于细菌域厚壁菌门(Firmicutes)的4个科(Leuconostocaceae,Streptococcaceae,Lactobacillaceae,Enterococcaceae)、6个属(Weissella,Pediococcus,Leuconostoc,Lactococcus,Lactobacillus,Enterococcus),其中除菌株zy-3、LY-87、ZH-54的16S r DNA基因序列与数据库EzBioCloud中的模式菌相似性100%外,其余13株活性菌株与模式菌存在一定的遗传差异(97.42%～99.93%),菌株zy-I与模式菌株Weissella cibaria(KACC11862T)的相似性仅为97.42%,推测为Weissella cibaria属中的潜在新种;16株活性菌株胞外代谢物对DPPH的抗氧化活性均大于胞内代谢物,且5株乳酸菌株(zy-4、zy-s6、YM-49、ZH-53、ZH-54)的胞外的DPPH清除能力均在45%以上,高于其它11株菌株。【结论】湛江海域动物肠道中存在较为丰富的抗氧化活性乳酸菌,并蕴藏潜在乳酸菌新种。     

海洋土曲霉C23-3与不同类型海洋微生物共培养对其次生代谢产物的影响

【目的】研究海洋土曲霉C23-3与不同类型海洋微生物共培养对其次生代谢产物的影响,挖掘土曲霉菌株C23-3的次生代谢潜力。【方法】将副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌和胶红酵母的活菌或灭活菌体分别以不同时间与土曲霉C23-3共培养;采用DPPH自由基清除法和Ellman法分别评价各提取物的抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性,采用滤纸片法比较各提取物的抗菌活性,采用HPLC指纹图谱分析各提取物化学成分的差异。【结果与结论】发现不同类型的微生物与土曲霉共培养均可激活一些原本沉默的活性次级代谢产物;菌株及共培养物的化学拮抗能力、HPLC指纹图谱中的特征代谢产物变化揭示在活菌培养体系中土曲霉占竞争优势;而且灭活菌体中可能存在某些信号物质,在12 d时对土曲霉群体自感应信号分子丁内酯-I的产生具有比活菌更强的刺激作用。研究结果为深入挖掘海洋真菌代谢潜力及抗老年痴呆等活性先导化合物的发现提供基础。     

扁舵鲣抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

【目的】从扁舵鲣(Auxis thazard)的木瓜蛋白酶酶解产物中分离鉴定具有较高1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率的抗氧化肽。【方法】用木瓜蛋白酶水解扁舵鲣,以DPPH自由基清除能力为检测指标,通过超滤、凝胶过滤层析和反向高效液相色谱分离抗氧化肽,再经过超高效液相/三重四级杆飞行时间质谱(UPLC/Xevo G2-XS QTOF)进行结构鉴定。【结果】从酶解产物中获得3种抗氧化肽,其氨基酸序列分别为β-丙氨酸-1-甲基-L-组氨酸(241 u)、Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(357 u)和Val-Glu(246 u)。【结论】扁舵鲣的木瓜蛋白酶酶解产物含有抗氧化活性的肽类,可为其抗氧化肽的开发提供理论依据。     

基于PCR和TOF-MS海洋源产脂肽芽孢杆菌筛选

【目的】准确高效分离红树林等海洋环境中产脂肽芽孢杆菌。【方法】将前期从红树林环境筛出具有抗菌活性的12株芽孢菌株作为研究菌株,采用溶血活性及排油作用对其中的可能产脂肽菌株进行初步筛选,并基于脂肽合成酶基因PCR扩增法对脂肽合成酶基因携带菌复筛,采用飞行时间质谱(TOF-MS)对所产脂肽进行鉴定。【结果】初步发现6株芽孢杆菌具有溶血活性,其中HY-5、HY-4和HN-9这3株具有排油能力,油层透明圈的直径分别为45、32和3 mm。PCR扩增检测到HY-5含有iturin、surfactin和bacillomycin D合成酶基因,HY-4含有iturin、surfactin合成酶基因,HN-9含有iturin合成酶基因。TOF-MS检测到HY-5和HY-4的发酵液含surfactin、iturin和bacillomycin 3种脂肽,HN-9的发酵液只含iturin。【结论】基于PCR与TOF-MS为核心的级联技术,建立一种海洋源脂肽产生菌快速筛选以及脂肽谱快速鉴定的方法,解决海洋源芽孢杆菌在常规培养基难合成脂肽造成的漏筛情况。     

一些海洋动植物区系的真菌分离和抑菌活性初步研究

从南海海域的鱼类、贝类、海藻以及海泥样品中分离出199株海洋真菌,分属于青霉属、曲霉属和酵母属等9个属,其中以青霉属和曲霉属真菌居多,分别占28.6%和26.8%。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌,筛选出抑菌活性菌株7株,其中2株既抗大肠杆菌又抗金黄色葡萄球菌,4株抗金黄色葡萄球菌,1株抗大肠杆菌。     

华贵栉孔扇贝酶法制备α-葡萄糖苷酶抑制肽工艺优化

【目的】为了进一步挖掘海洋贝类潜在的降血糖功能。【方法】选用华贵栉孔扇贝闭壳肌为原料,以抑制α-葡萄糖苷酶活性为评价指标,采用正交试验法和响应面分析法优化α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备工艺。【结果】华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)、马氏珠母贝(Pinctada fucata)和栉江珧(Atrina pectinate)等三种海洋贝类的闭壳肌酶解产物均对a-葡萄糖苷酶、a-淀粉酶和脂肪酶具有抑制活性;正交试验和响应面综合分析结果表明,华贵栉孔扇贝闭壳肌制备a-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳工艺:复合蛋白酶酶添加量5 500 U/g,酶解温度57℃,酶解pH=7,酶解时间4 h,其酶解液中小肽含量21.64 mg/mL,a-葡萄糖苷酶的抑制率达到31.53%。【结论】利用响应面法可优化制备α-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺。     

鳙鱼鱼鳔黏多糖的提取及其抗氧化性活性评价

【目的】探讨鳙鱼(Aristichthys nobilis)鱼鳔黏多糖的提取工艺及提取物的化学组成及抗氧化活性。【方法】采用热水浸提法和碱液浸提法提取黏多糖,用GC-MS法测定分析所提取多糖的化学组成和抗氧化活性等性质。【结果】碱液浸提法的最佳工艺条件为料液质量体积比(g/m L)1∶20、碱液质量分数1%、提取温度70℃、提取时间为4 h,在此条件下,黏多糖的提取率为5.58%;热水浸提和碱液浸提得到的鳙鱼鱼鳔黏多糖量分别为5.3%和25.33%;气质联用色谱(GC-MC)测定结果显示,热水提取的黏多糖(WANVM)主要由质量分数13.72%木糖、19.57%甘露糖、16.11%葡萄糖及32.49%半乳糖构成;碱液提取的黏多糖(AANVM)主要由质量分数50%甘露糖和34.87%半乳糖构成。在相同质量分数条件下,WANVM清除羟基自由基、DPPH自由基及总还原力均高于AANVM。【结论】碱液浸提对黏多糖的提取效果优于热水浸提,AANVM、WANVM组分不同,且前者抗氧化活性略高于后者。     

饲料中添加4种中草药制剂对大口黑鲈幼鱼生长和抗氧化能力的影响

【目的】研究4种中草药制剂对大口黑鲈幼鱼生长和抗氧化能力的影响。【方法】在基础饲料中分别添加姜黄素(50 mg/kg)、复方中草药Ⅰ(板蓝根、大黄,5 g/kg)、复方中草药Ⅱ(黄芩、黄柏、大黄、大青叶,5 g/kg)、复方中草药Ⅲ(辣蓼、青蒿、苍耳草、赤小豆、苦杏仁,5 g/kg),连续饲喂初始体质量(19.53±5) g大口黑鲈幼鱼60d,表观饱食投喂,每天投喂2次。【结果】饲料中添加4种中草药制剂对大口黑鲈幼鱼成活率、特定生长率、饲料系数的影响不显著(P0.05);饲料中添加复方中草药Ⅱ显著提高血浆SOD活性(P0.05),复方中草药Ⅲ显著增高肝脏中脂肪含量(P0.05)。【结论】饲料中添加适量的4种中草药制剂对大口黑鲈幼鱼生长不造成不利影响,复方中草药Ⅱ可提高机体抗氧化能力,但复方中草药Ⅲ会加大幼鱼肝脏病变风险。     

化学物质诱导对马氏珠母贝眼点幼虫附着的影响

【目的】研究血清素(5-HT)、蜕皮激素、γ-氨基丁酸(GABA)、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤对马氏珠母贝眼点幼虫附着的影响。【方法】以不同浓度的5-HT、蜕皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤溶液处理马氏珠母贝眼点幼虫,不同时间后,分析眼点幼虫附着率的变化。【结果】在24~96 h作用时间里,5-HT、蜕皮激素、GABA对眼点幼虫附着的诱导效果整体上均呈上升趋势;在24~120 h作用时间里,腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤对眼点幼虫附着的诱导效果整体上呈上升趋势。眼点幼虫在10^-5 mol/L的5-HT和GABA处理24、48、72和96 h后,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10^-5 mol/L的蜕皮激素处理24 h和72 h,10^-6 mol/L的蜕皮激素处理24 h和96 h,10^-7 mol/L的蜕皮激素处理24 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L腺嘌呤核苷处理24、48、72和120 h,1μmol/L腺嘌呤核苷处理24、48、72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L次黄嘌呤核苷处理48和72 h,1μmol/L次黄嘌呤核苷处理48、72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01);10μmol/L的次黄嘌呤处理72、96和120 h,附着率均显著高于对照组(P<0.01)。【结论】5-HT、蜕皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤溶液在适宜的浓度和处理时间均可诱导马氏珠母贝眼点幼虫附着,其中10^-5 mol/L的5-HT处理24 h对附着率的诱导效果最佳,可达对照组的6.3倍。     

微酸性电解水结合复合保鲜剂对凡纳滨对虾冷藏期间蛋白特性影响

【目的】研究微酸性电解水(SAEW)结合迷迭香提取物(RE)-柠檬酸(CA)复合保鲜剂处理对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)冷藏期间蛋白特性变化影响,探讨此法用于虾类贮藏保鲜的效果。【方法】将样品分别经SAEW、质量分数4%RE+质量分数1%CA(RC)、SAEW结合RC(SAEW+RC)和无菌水(CK)处理10 min后,自然沥干15 min,装入PE保鲜袋于(4±1)℃冰箱中保藏,每2 d测定样品的pH值、总挥发性盐基氮(TVB-N)、总巯基含量、Ca²⁺-ATPase活性、化学键、肌原纤维小片化指数(MFI)与内源荧光强度(IFI)等指标,并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行综合分析。【结果】复合处理能延缓凡纳滨对虾贮藏期间pH与TVB-N值的升高,抑制总巯基含量下降,CK、RC、SAEW与SAEW+RC组样品的Ca²⁺-ATPase活力分别由初始0.16、0.17、0.17与0.17μmol/(mg·min)降至0.12、0.13、0.12与0.14μmol/(mg·min),MFI值较初始值上升1.88、1.73、1.76和1.54倍,可见SAEW+RC对延缓Ca²⁺-ATPase活性下降与MFI值的上升有较好作用。同时,SAEW+RC处理还能减缓蛋白质分解、氧化和变性,保持蛋白质化学键与IFI值的相对稳定。【结论】微酸性电解水结合复合保鲜剂处理能较好抑制凡纳滨对虾冷藏期间的蛋白质氧化分解,延缓其品质劣变。     

禁食暂养对卵形鲳鲹有水保活生理响应的影响

【目的】探究禁食暂养对卵形鲳鲹有水保活生理响应的影响,为卵形鲳鲹的保活运输奠定基础。【方法】通过测定暂养过程中水体的总氨氮和pH值、卵形鲳鲹血液生理生化指标、肌肉氧化应激指标等的变化,分析确定卵形鲳鲹有水保活的禁食暂养条件。【结果与结论】禁食暂养过程中,随着暂养时间的延长,水体总氨氮含量与pH值显著上升,但在禁食暂养时间为6 h时,其总氨氮质量浓度为3.22 mg/L和pH值为7.80;禁食暂养6 h可以降低或减少卵形鲳鲹的应激,使血液中乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST)活性以及皮质醇(Cortisol)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)和总胆固醇(T-CHO)含量处于较低水平,分别为2785.53 U/L、19.04 U/L、158.72 ng/mL、2.98 mmol/L、4.35 mmol/L和4.96 mmol/L;同时减轻了应激带来的肌肉组织氧化损失,使过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量维持在较低水平,分别为6.34 U/L和5.86 mmol/L;卵形鲳鲹适宜的暂养条件为在鱼水比m鱼∶m水=1∶20和(25±1)℃的洁净海水中暂养6 h。     

Responses of marine-derived Trichoderma fungi to seawater and their potential antagonistic behaviour

To explore the metabolic responses of marine-derived Trichoderma fungi to environmental stresses, the survivability, metabolism, and antagonism of ten marine isolates have been examined. Their survival in both freshwater and seawater indicates them to be facultative marine fungi, but they are more adaptable to marine environment. Most of them feature strain-specific and positive metabolic responses to seawater, which also usually result in the higher proportions of heteroatom-bearing and unsaturated units in mycelial constituents. Seawater factors can promote many strains to produce bioactive metabolites,including plant pathogen-and marine phytoplankton-inhibitory and marine animal-toxic ones, but the ef fects of NaCl are often weak or negative. The inhibition of marine phytoplankton corresponds to the intracellular accumulation of heteroatom-bearing and unsaturated units under seawater condition, and the varied toxicities to marine animals further signify the divergences of lipophilic exudates under dif ferent conditions. The results may contribute to further understanding and mining the structural diversity and biological activity of secondary metabolites from marine-derived Trichoderma fungi.     

不同附着基质对长茎葡萄蕨藻生长及附着效果的影响

【目的】探索不同附着基质对长茎葡萄蕨藻(Caulerpalentillifera)直立枝生长及藻体附着效果的影响。【方法】对长茎葡萄蕨藻直立枝以垂直砂埋、水平砂埋、塑料网网夹、尼龙网网夹及无附着基质(对照组)五种附着方式进行实验,探究长茎葡萄蕨藻直立枝的生长、附着能力、光合特性参数及营养含量的变化。【结果】垂直砂埋处理下,藻体的新生直立枝质量、质量长度比及球状小枝的直径与其他各组相比最优(P <0.05),分别是0.313 3 g、0.086 6 g/mm和1.67 mm,是对照组的7.38、9.62、1.67倍;水平砂埋与对照组相比,藻体附着能力有显著增强(P <0.05),假根数为26,长度为30.77 mm及假根附着砂砾质量为0.566 0 g;除对照组外,各组最大光能转化效率(Fv/Fm)和实际光化学效率Y(II)值呈先下降后上升趋势,24 h后垂直沙埋藻体Fv/Fm和Y(II)最快恢复原始水平,为0.856μmol·m~(-2)·s~(-1)和0.851μmol·m~(-2)·s~(-1),显著高于其余组(P <0.05);垂直砂埋与水平砂埋处理后的藻体,其可溶性糖含量分别比对照组显著降低34.24%和33.93%(P<0.05),而网夹处理后,没有显著差异(P> 0.05)。垂直砂埋处理对藻体总蛋白含量增加有显著促进作用,是对照组的1.26倍(P <0.05)。【结论】长茎葡萄蕨藻直立枝以垂直砂埋附着方式生长最佳,以水平砂埋附着方式附着更牢固。     

球等鞭金藻的异养培养

【目的】探索球等鞭金藻的异养培养条件。【方法】以球等鞭金藻3011为研究对象,对其进行避光异养培养,采用单因素实验,找出适合其异养生长的碳源、氮源及磷源。【结果与结论】葡萄糖、尿素和磷酸二氢钾分别为较适于球等鞭金藻异养培养的碳源、氮源和磷源;异养状态下球等鞭金藻生物量较高,在葡萄糖浓度40 g/L、尿素1.0 g/L、KH₂PO₄13.6 mg/L时微藻培养效果最佳,30℃下培养48 h微藻密度达109 mL^-1,培养96 h密度超过1010 mL^-1。     

急冷与空气暴露联合胁迫对凡纳滨对虾生理代谢影响

【目的】探明无水保活流通过程中凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)响应急冷(acute cold,AC)与空气暴露(waterless duration,WD)联合胁迫的生理代谢调节规律。【方法】研究模拟产业运输实际,分析联合胁迫(AC+WD)进程中凡纳滨对虾血液和肝胰腺典型生化指标,以及肝胰腺组织病理变化。【结果】AC胁迫后,凡纳滨对虾生理应激指标血清皮质醇含量由正常组(normal control,NC)的(326.90±4.61)pg/mL显著增加到AC组的(427.16±7.92)pg/mL(P<0.05),AC+WD组则随时间延长而逐渐降低。血清葡萄糖含量在联合胁迫6 h后达到最大值(26.31±1.05)mg/dL,乳酸在9 h达到峰值(7.90±0.11)mmol/L。AC及AC+WD组中血蓝蛋白、尿素氮和肌酐含量较NC组均发生不同程度的增加,而总蛋白含量先升后降,总胆固醇和甘油三酯含量呈胁迫时间依赖性下降。血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、酸性和碱性磷酸酶活力呈上升趋势,并在9 h达到峰值。以上生化指标在胁迫复苏组有所恢复,表明AC+WD双重胁迫引起凡纳滨对虾物质代谢紊乱,复苏后机体生理应激和代谢系统发生一系列代偿性调节,且胁迫进程中肝胰腺组织病理损伤特征进一步解释了凡纳滨对虾响应环境联合胁迫的结构基础。【结论】无水保活流通过程中双重胁迫时间依赖性改变凡纳滨对虾生理应激水平和物质代谢,在9 h时可明显造成肝胰腺组织结构损伤,进而影响机体存活。     

光及补料条件对室内管道光反应器中三角褐指藻生长和岩藻黄素积累的影响

【目的】制备富含岩藻黄素的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生物质。【方法】采用470 L室内管道光生物反应器系统,研究自养培养下光源、调光策略、补料培养操作条件对于细胞生长、生物量浓度和岩藻黄素积累的影响。【结果】在采用LED灯、梯度提升照度及重复补料半连续培养模式下,三角褐指藻细胞密度、生物量和岩藻黄素产率最高分别可达3.16×10⁷mL^-1、1.64 g/L和1.90 mg/(L·d),分别是日光灯为光源条件下的2.77倍、3.09倍和2.38倍(P<0.01)。【结论】在管道光生物反应器中获得的自养培养条件,可强化三角褐指藻生物量和岩藻黄素积累,为三角褐指藻积累岩藻黄素的室内可控规模化技术开发提供指导。