链状亚历山大藻铜胺氧化酶基因的克隆和表达分析

本文以链状亚历山大藻为实验材料,克隆了2个铜胺氧化酶基因,分别命名为cad-1和cad-2。对获取的基因序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR技术分析了cad-1和cad-2在链状亚历山大藻不同生长时期的表达。结果发现,cad-1开放阅读框全长1 023bp,编码340个氨基酸;cad-2开放阅读框全长1 800bp,编码599个氨基酸,含一个内含子1 065bp。2个基因编码的蛋白与颗石藻和抑食金球藻的铜胺氧化酶有较近的亲缘关系。荧光定量PCR分析结果显示,cad-1和cad-2在对数期和衰亡期分别是下调表达和上调表达。依据铜胺氧化酶的功能和链状亚历山大藻衰亡的相关研究,推测铜胺氧化酶可能通过催化多胺产生过量过氧化氢的方式参与链状亚历山大藻赤潮衰亡的过程。     

链状亚历山大藻组蛋白H3基因克隆与生长过程中的表达分析

链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种典型的产毒赤潮甲藻。甲藻曾被认为没有组蛋白,但近年来在多种甲藻中检测到全部四个核心组蛋白的活跃转录,而目前对甲藻中组蛋白表达模式与具体功能还缺乏深入的研究。本文报道了链状亚历山大藻组蛋白H3变体之一H3.c的全长ORF序列的克隆和分析;分析了链状亚历山大藻生长过程中组蛋白H3在基因和蛋白水平的表达。目前研究发现的链状亚历山大藻H3变体共三个,其中H3.b在N末端序列与其他物种差异最大,为链状亚历山大藻特有的H3变体。对数生长期的组蛋白H3在基因与蛋白水平上均活跃表达,但表达量并不会随着爆发性增长而显著变化,其中H3.b的基因表达在对数末期呈现上调;培养至衰亡期,各H3变体表达均下调,尤其在蛋白水平上呈现明显衰减。结合前期研究,本文认为链状亚历山大藻三个H3均为复制非依赖型(RI)变体,一些变体可响应伴随藻不断生长而逐渐增强的细胞密度等复杂胁迫,推测其参与某些表观遗传修饰,调控生长进程;而衰亡期基于H3的表观遗传调控受到抑制。     

加权基因共表达网络探究链状亚历山大藻爆发性生长的分子机制

链状亚历山大藻(Alexandrium pacificum)作为典型的产毒赤潮甲藻,分布广泛,而对其爆发性生长的研究将有助于探究由其引发的赤潮的分子机制。本研究通过模拟赤潮爆发的条件对链状亚历山大藻进行表达谱测序,利用表达谱测序后得到的基因表达量数据,采用加权基因共表达网络(WGCNA)构建方法探究链状亚历山大藻的爆发性生长的分子机制。通过计算基因间表达量的相关性得到了35个基因共表达模块,将基因共表达模块与链状亚历山大藻爆发性生长性状相关联,在爆发性生长阶段,有6个显著性相关的模块,基于KEGG及GO功能富集分析,这些模块涉及蛋白质的加工合成、核糖体的合成,电子传递,碳水化合物代谢等过程,表明了细胞代谢能力的提升,为细胞增殖提供了物质基础。此外有大量的未知功能的枢纽基因被发现,基因模块可以用于推测这些基因的功能,从而为以后挖掘新基因,探究潜在的调控机制提供了基础。     

一种快速制备甲藻细胞PCR扩增DNA模板的方法

报道了一种快速制备PCR扩增甲藻细胞模板DNA的方法。以赤潮甲藻塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）和链状亚历山大藻（Acatenella）为目标藻，对藻液预处理后直接用于PCR扩增，获得5,8S核糖体RNA基因及其两侧的核糖体RNA基因转录单元内基因间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列片段，成功测序。此方法避免了复杂的DNA提取过程。     

氮限制下链状亚历山大藻DMSP合成与生理变化的研究

DMSP是一种重要的生源有机硫化物,甲藻不仅是海洋浮游植物的重要组成部分,同时也是DMSP的重要生产者,但有关DMSP在甲藻中功能的研究比较匮乏。本文首次在链状亚历山大藻中检测到DMSP产生,研究了氮限制对藻细胞生长、细胞体积、活性氧、光合作用能力和DMSP浓度的影响。结果发现,氮限制能引起细胞生长限制及藻细胞DMSP浓度的显著增加。相关性分析发现,细胞活性氧水平和DMSP浓度之间具有强相关关系(Pearson相关系数=0.83),结合实验室之前氮限制下细胞氧化胁迫状态的结果,提示DMSP在藻细胞中具有抗氧化的作用。另外,氮限制下藻细胞体积的显著增大,光合活性降低,提示DMSP在链状亚历山大藻中可能具有渗透压调节的作用。我们的观察进一步验证了前人的发现。本研究还首次分析了链状亚历山大藻中与DMSP合成相关的基因,结果发现,cad-1和cad-2基因可能都参与了DMSP的合成,但发挥不同的作用。实验结果为在甲藻中深入研究DMSP的功能奠定一定的基础,也为揭示甲藻中DMSP合成相关途径提供参考。     

四种/株亚历山大藻(Alexandrium)毒性的比较研究

通过对塔玛亚历山大藻(ATHK和AT-6藻株)、链状亚历山大藻(ACDH藻株)和微小亚历山大藻(AM-1藻株)的PSP毒素含量和组成以及它们分别对轮虫、黑褐新糠虾和鲈鱼存活影响的比较研究发现:塔玛亚历山大藻AT-6藻株不产生麻痹性贝毒毒素PSP,而塔玛亚历山大藻ATHK、链状亚历山大藻ACDH和微小亚历山大藻AM-1均产生PSP毒素,其总含量分别为19.74、5.395、5.57fmol/cell(2.60、0.36、1.61pgSTXeq/cell)。塔玛亚历山大藻AT-6对轮虫、黑褐新糠虾和鲈鱼这三种生物均没有不利影响;对于轮虫,塔玛亚历山大藻ATHK和链状亚历山大藻ACDH的96hLC50分别为:200和1200cells/ml,而微小亚历山大藻AM-1无不利影响;对于糠虾,塔玛亚历山大藻ATHK、链状亚历山大藻ACDH和微小亚历山大藻AM-1的96hLC50分别为7000、11000、16000cells/ml;对于鲈鱼,这三株藻的96hLC50分别为3700、4000、20000cells/ml。四株亚历山大藻对三种生物的毒性大小与其PSP毒素含量和组成无直接的相关关系,其毒性作用可能来自其他未知毒性物质。塔玛亚历山大藻ATHK不同组分分别对三种生物的毒性比较研究表明:藻细胞重悬液和藻液对三种生物的不利影响最为显著,去藻过滤液和细胞碎片对轮虫和鲈鱼没有明显影响,但糠虾的存活率有所下降;细胞内容物对轮虫和糠虾也无影响,但对鲈鱼的存活有一定影响。以上研究表明:不同亚历山大藻的毒性大小存在差别,其对不同生物的危害机制也不相同,除PSP毒素外,亚历山大藻可能还存在其他的毒性物质。     

两种甲藻对人工海水中胶体磷的利用初探

采用批次培养方法,研究了东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenlla)对胶体磷的生物可利用性,并初步探讨了甲藻利用胶体磷的机制问题.结果表明东海原甲藻和链状亚历山大藻均能利用胶体磷生长繁殖.东海原甲藻在接种11d后细胞密度在无机磷和胶体磷培养基中分别为10.53×107和3.43×107个/dm3.链状亚历山大藻在接种11d后细胞密度在无机磷和胶体磷培养基中分别为39.0×105和28.3×105个/dm3.通过对比细胞密度,胶体磷对东海原甲藻生长的促进作用要低于无机磷的作用;胶体磷对链状亚历山大藻生长的促进作用与无机磷的作用相当.东海原甲藻和链状亚历山大藻在胶体磷源下碱性磷酸酶活性迅速升高,前期均显著高于各自无机磷组的碱性磷酸酶活性,碱性磷酸酶活力最高值分别为0.29和0.30μmol/(dm3·h).初步结果表明,两种甲藻均能通过碱性磷酸酶的降解来利用胶体磷.     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。     

渤海裸甲藻和链状亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素分析

目的:分析渤海裸甲藻(Gymnodinium sp.)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)的麻痹性贝毒毒素,为渤海天津海域的赤潮研究积累基础数据。方法:通过实验室培养裸甲藻和链状亚历山大藻,选取对数生长期、平台生长期的裸甲藻以及平台生长期的链状亚历山大藻,利用高效液相色谱法(HPLC)对这两种微藻进行麻痹性贝毒(PSP)毒素分析。结果:裸甲藻细胞内不含有麻痹性贝毒(PSP);链状亚历山大藻细胞内含有C毒素和GTX1-4毒素,该微藻每个细胞毒素含量约为10.81 fmol/cell。结论:裸甲藻细胞内虽不含有麻痹性贝毒(PSP),但不能排除其含有其它毒素的可能。链状亚历山大藻细胞内含有麻痹性贝毒(PSP),属于有毒微藻,需要对其进行密切监测。     

6种赤潮甲藻对荧光标记藻类的吞噬行为研究

选取6种在中国沿海广泛分布的赤潮甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)和锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea),采用经5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(DTAF)标记灭活的荧光饵料藻进行投喂,观察目标甲藻是否存在吞噬行为,研究光照、营养盐条件对目标甲藻的吞噬行为的影响。结果发现,链状亚历山大藻能吞噬旋转海链藻(Thalassiosira curviseriata),东海原甲藻能摄食球等鞭金藻(Isochrysis galbana),但其摄食概率非常低,且不受光照和营养盐条件的影响。实验中,未观测到米氏凯伦藻、海洋原甲藻、微小原甲藻和锥状斯氏藻的吞噬行为。在黑暗中培养48-72h后,目标甲藻均出现不同程度的死亡,尤其是东海原甲藻和链状亚历山大藻。虽然东海原甲藻和链状亚历山大藻具吞噬行为属于混合营养生物,但光合自养是目标甲藻获取营养、维持生长最主要的方式。     

混合培养条件下几种赤潮藻对无机磷源的竞争生长研究

采用批次培养方式,研究混合培养的几种赤潮藻东海原甲藻(PrDrocentrum donghaiense)与中肋骨条藻(Skeletonema costatum)及东海原甲藻与链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)对溶解无机磷源的竞争生长响应.结果表明,在富磷及贫磷的培养条件下,中肋骨条藻的比生长率远超过东海原甲藻,而成为培养体系中的绝对优势种.在东海原甲藻与链状亚历山大藻的混合培养体系中,原甲藻大量死亡,可能存在亚历山大藻对原甲藻的他感作用.培养体系中,碱性磷酸酶活性随藻类磷胁迫而显著升高,可能在后期种群利用代谢有机磷源时发挥重要作用,且在不同培养体系中表现出酶活性大小及状态的差异性,该结果可能影响浮游植物对有机磷源的利用效率.     

微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)的氮磷吸收、生长、产毒动态变化

采用浮游植物计数法、高效液相色谱串联质谱法、分光光度法等分析方法,探索了微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)在批次培养过程中氮磷吸收、产毒、生物量、p H等参数的动态变化关系。结果表明,微小亚历山大藻对磷的吸收迅速,可以将磷储存于体内,待生长使用。该藻对氮的吸收相对缓慢,环境中氮缺乏时,产毒量不再增加,说明氮对产毒有着重要的调控作用。在第二对数期中出现了碳限制环境,导致叶绿素a在碳限制条件下无法表征藻的生物量,相反,叶绿素a和生物量呈负线性关系,可能是叶绿素转化成其它含碳物质,用于生长。毒素不仅存在于细胞体内,培养液中(胞外)也含有毒素,并且胞外毒素从稳定期开始逐渐升高。胞内毒素的组成中GTX1/4占据绝对优势,GTX2/3含量相对较少。生长延缓期和第一对数期,各种毒素组成比例相对稳定,而在随后的生长期内,GTX1/4在总毒素中的占比逐渐上升,GTX2/3占比逐渐下降,表明微小亚历山大藻毒素组成会随着生长周期的变化而发生变化。     

基于鳃的microRNA转录组研究中国蛤蜊对重金属镉的响应

中国蛤蜊（Mactra chinensis）是一种重要的经济贝类,分布于我国的辽宁和山东。近年来,生境恶化和过度捕捞导致我国蛤蜊资源量减少。我们利用Illumina Hiseq-2500平台对中国蛤蜊鳃的microRNA转录组进行测序,运用差异表达寻找对镉刺激有响应的功能microRNA。结果显示对照组获得了14 415 256条clean reads,实验组获得了15 570 111条clean reads。在这些reads中一共存在14 584 077小RNA,包括1 898 035条unique小RNA,其中对照组和实验组共有187 859条unique小RNA。两个组的小RNA文库的片段长度分布是相似的,大部分小RNA长度分布在26~27 nt。在对照组文库中最丰富的片段长度是27 nt,其次是28 nt、26 nt和23 nt。在实验组文库中,数量最丰富的片段长度是26 nt,其次是27 nt、28 nt和23 nt。经过对序列前体以及结构特征的分析,发现这两个组中一共有50个microRNA,其中已知的是38个,新发现的是12个。对照组和实验组microRNA含量最丰富的片段长度是23 nt。通过差异表达分析,5个microRNA基因具有显著性差异且从对照组到实验组的表达量是上调的,其余45个没有显著性的差异。把这50个序列与中国蛤蜊转录组进行比对,一共找到了542个靶基因。5个具有表达差异的基因一共比对到11个靶基因。把这11个靶基因与NCBI数据库比对,4个靶基因在COG中得到注释,1个靶基因在GO中得到注释,6个靶基因在KEGG中得到注释,11个靶基因在nr数据库中得到注释,注释到的基因有泛素蛋白连接酶E3,Wnt信号通路,G蛋白信号调控等。     

对虾microRNA的最新研究进展

miRNA(microRNA)是一类广泛存在的长度约为18~25nt(nucleotides)的单链非编码小RNA。它在转录后水平通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻译来调控靶基因的表达,在生物的生长、发育、代谢和免疫等多种生命活动中发挥重要作用。对虾miRNA的研究起步较晚,但近6年来取得了突飞猛进的进展。本文综述了对虾miRNA的发现与鉴定、作用机制及其生物学功能方面的研究概况,并对对虾miRNA的研究前景进行了展望。     

3种赤潮微藻对UV-B辐射处理的敏感性

通过实验生态学的方法,研究了赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的生长对UV—B辐射增强的响应。结果表明,UV—B辐射处理对赤潮异弯藻的生长始终表现出抑制效应,而低剂量的UV—B辐射处理对亚历山大藻和中肋骨条藻的生长有刺激作用,高剂量的UV—B辐射处理对亚历山大藻和中肋骨条藻的生长仍然显示出抑制作用。UV—B辐射对赤潮异弯藻、亚历山大藻和中肋骨条藻的96h半抑制剂量分别为1．63、2.34和2．58J／m^2。     

不同类型含磷营养物质对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)生长和毒素产生的影响

采用显微镜细胞计数和麻痹性贝毒的高效液相色谱分析方法,通过对比磷酸二氢钾、磷酸甘油和三磷酸腺苷（ATP）等含磷营养物质对微小亚历山大藻生长和毒素产生的影响,研究了微小亚历山大藻对不同类型含磷营养物质的利用情况.结果表明,在磷限制条件下,加入磷酸二氢钾、磷酸甘油和ATP均能促进微小亚历山大藻的生长,所获得的最大藻细胞密度分别为22700、28400和27800藻细胞/ml,对数期生长速率分别为0.12/d、0.14/d和0.15/d,溶解态有机磷对藻生长的促进作用稍好于溶解态无机磷.三种含磷营养物质对毒素产生的效应没有明显差别,稳定期藻细胞毒素含量分别为22.87、23.98和21.80fmol/cell.磷限制对毒素组成的影响很大,磷限制条件下膝沟藻毒素GTX1/4的含量占绝对优势,GTX2/3含量很少.在添加含磷营养物质后,GTX1/4所占比例降低,GTX2/3比例增加,说明磷限制显著改变了微小亚历山大藻的毒素组成.对藻体碱性磷酸酶活性分析的结果显示,磷限制组具有最高的碱性磷酸酶活性,添加有机磷化合物实验组的碱性磷酸酶活性显著高于添加无机磷化合物的实验组.研究结果表明,微小亚历山大藻可以利用实验中采用的无机磷化合物和有机磷化合物,但其利用溶解态有机磷化合物的机制尚不清楚,可能是通过诱导合成碱性磷酸酶来水解培养基中的溶解态含磷有机物,从而释放无机磷酸盐用于藻细胞的生长.     

基于玛氏骨条藻转录组的脂肪酸合成途径分析

本研究利用Illumina Hiseq2000对不同生长时期的玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)进行转录组测序,得到的转录本通过NR、NT、Swiss-Prot和KOG数据库进行功能分类,通过GO和KEGG数据库进行相关代谢途径分析和基因差异表达分析,在此基础上构建了S.marinoi的脂肪酸生物合成途径,发现共存在26种酶和蛋白对应的33个编码基因,对这33个基因序列进行比对发现其与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的同源性较高。在该代谢通路中,S.marinoi在不同生长时期出现显著差异表达的基因有15个。与指数期相比,柠檬酸裂解酶和长链酰基-CoA合成酶(Comp14198_c0)的编码基因在稳定期和衰亡期出现显著下调表达,而柠檬酸合酶的编码基因仅在稳定期出现显著下调表达。与之相反的是,以乙酰-CoA羧化酶编码基因为代表的12个编码基因在稳定期和衰亡期均出现了显著上调。通过分析,初步推测S.marinoi在稳定期的脂肪酸合成能力高于指数期。这些信息为海洋微藻脂肪酸生物合成途径的研究提供了理论基础,有助于对S.marinoi进行基因改造,提高脂肪酸的合成量。同时,又能为赤潮的防治提供新的思路。     

浒苔Up-MIR-843及其靶基因分析

非编码小分子RNA (non-coding small RNAs, microRNAs)在植物的生长,发育和应对非生物胁迫过程中发挥着重要作用。本研究分析了氮剥夺和高温刺激条件下,浒苔Up-miR-843及其靶基因的表达变化。结果表明,生物信息学分析可以得到184个Up-miR-843靶基因。氮缺乏可以显著增加Up-miR-843的水平,同时降低细胞周期相关基因Cyclin A3和Cyclin L的表达,而高温刺激对Up-miR-843的表达不产生影响。同时,Up-miR-843高表达的浒苔与正常条件培养的浒苔比较,生物量和光合作用合成速率显著增加。因此,我们推测氮剥夺和高温应激响应microRNAs可能通过介导其靶基因表达,调节浒苔的生长。     

生物胺对赤潮藻生长的影响作用初探

选取东海赤潮高发区常见的两种甲藻[东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)]和两种硅藻[中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、海链藻(Thalassiosirasp.)],以2-苯基乙胺、腐胺、亚精胺、精胺四种赤潮水体中常见的生物胺为因素,设置0、5、25、100nmol/L四个浓度水平,进行L16(45)正交添加培养实验。根据Logistic生长模型进行曲线拟合,分析得到的生长参数。结果显示,不同的生物胺对各赤潮藻生长影响的大小、趋势均存在差异。其中,2-苯基乙胺对四种赤潮藻的生长影响最显著。高浓度的2-苯基乙胺对中肋骨条藻的生长具有明显的抑制作用,对塔玛亚历山大藻的生长具有明显的促进作用。多胺物质(腐胺、亚精胺和精胺)对甲藻(东海原甲藻和塔玛亚历山大藻)生长的促进作用大于硅藻(海链藻和中肋骨条藻)。多胺中的亚精胺对塔玛亚历山大藻和海链藻的生长影响最大,精胺对东海原甲藻和中肋骨条藻的生长影响最大。多胺可能是2010年东海赤潮由中肋骨条藻向东海原甲藻演替的一个诱导因素,其中精胺可能发挥的作用较大。     

罗源湾口柱状沉积物中的甲藻孢囊

通过时福建罗源湾口海域KMZK5柱状沉积物中甲藻孢囊的分析，共鉴定出15属30种甲藻孢囊，对比发现这30种甲藻孢囊是该湾以前未被记录的种类．其中12种是附近海域也未曾发现的种类，6种为有毒种类：缘亚历山大藻、小型亚历山大藻、塔玛亚历山大藻、具剌膝沟藻、链状裸甲藻、锥状斯氏藻，同时对甲藻孢囊的主要属种和有毒种类的丰度、分布在垂直方向上的变化特征进行了初步研究。