海豚链球菌及其胞外产物诱导的牙鲆血清抗体应答分析

海豚链球菌(Streptococcus iniae)是引起鱼类链球菌病的主要致病菌,对牙鲆(Paralichthys olivaceus)等养殖鱼类造成巨大危害。本文制备了海豚链球菌强毒株NUF849的福尔马林灭活全菌(FKC)、胞外产物(ECPs)及全菌与胞外产物的混合物(FKC+ECPs),以其免疫牙鲆,在免疫后第42天分别以海豚链球菌NUF849和NUF812攻毒,并在免疫前以及免疫后第7、14、21、28、35、42天与攻毒后第7天取样,分析3种免疫原以及免疫后再攻毒所诱发的血清抗体应答。结果显示,免疫后牙鲆体内产生了分别针对FKC和ECPs的特异性抗体,且各免疫组中FKC诱导的抗体水平较ECPs高,2种抗原间存在一定程度的交叉反应;FKC+ECPs组的两种抗体水平显著高于其他组(P0.05);攻毒后第7天2种抗体水平都显著升高(P0.05),并且免疫原来源菌株NUF849攻毒组的2种抗体水平高于非免疫原来源菌株NUF812攻毒组。攻毒后存活牙鲆的血清对NUF849、NUF812全菌蛋白及其胞外产物进行Western-blot分析,结果显示抗血清与全菌蛋白的阳性反应条带位于25~100kDa,与胞外产物的阳性反应条带位于18~100kDa。本文结果表明灭活海豚链球菌与胞外产物都能够诱发牙鲆产生特异性抗体,二者混合物的免疫效果更好,且NUF849来源的免疫原可以刺激牙鲆产生针对NUF812菌株的交叉保护抗体,为牙鲆海豚链球菌疫苗成分的筛选提供了基础资料。     

不同温度下罗非鱼人工感染海豚链球菌后血液生化指标及组织病理

在28℃、33℃两种温度下,用海豚链球菌人工感染尼罗罗非鱼后,测定尼罗罗非鱼血液生化指标。结果显示:两个温度水平病鱼的血清总蛋白(TP)随时间延长都呈现升高趋势;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性随时间延长先升高后降低再升高,33℃实验组ALT、AST活性比28℃实验组达峰值时间短,并显著高于对照组(p<0.05);尿素、钾(K+)含量随时间延长逐渐升高后降低,钠(Na+)含量先升高后降低再升高,肌酐含量呈上升趋势;血清碱性磷酸酶(AKP)活性28℃实验组呈先升高后降低趋势,33℃实验组呈升高趋势;超氧化歧化酶(SOD)活性随时间延长先升高后降低再升高,33℃实验组各个时间点基本高于28℃实验组;球蛋白(GLO)随感染后时间延长呈现升高趋势,至120 h,显著高于对照组(p<0.05),但温度组间各时间点没有显著差异(p>0.05)。组织病理学观察发现,33℃实验组肝细胞、肾小管上皮细胞水肿变性;28℃实验组肝细胞出现嗜酸性小体;肾小管上皮细胞出现嗜酸性的红色小体,颗粒变性。表明感染海豚链球菌的尼罗罗非鱼肝脏、肾脏均有损伤,造成功能障碍,高温时损伤更严重。     

乳酸链球菌L318的培养及其对海洋弧菌的抑制作用

以海洋弧菌作为检测菌，采用平板抑菌圈检测法，对发酵上清液的抑菌性质和在不同培养条件下，包括碳源、氮源、初始培养基pH值、温度、接种量和装液量等，乳酸链球菌L318的生长和对海洋弧菌的抑制作用进行研究。结果表明，含有乳链菌肽的发酵上清液经稀释2～5倍后，具有较强的抑菌活性；乳链菌肽在酸性条件下比在碱性条件下稳定。采用蔗糖或葡萄糖碳源，酵母膏、蛋白胨和牛肉膏为复合氮源，能够获得菌体的最佳生长和最佳的抑菌活性，最适的对海洋弧菌的抑制条件为温度30℃，接种量2%～4%，装液量100ml。初始pH值对海洋弧菌的抑制作用不明显。     

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) 三重PCR 快速检测方法的建立与应用

参照GenBank发表的无乳链球菌sip、cpsE这两个高度保守基因设计两组特异性引物,应用已报道的无乳链球菌cpsL基因高度保守序列的引物作为阳性对照引物,经反应条件和反应体系参数优化,建立一种检测无乳链球菌的三重PCR方法,并应用本三重PCR方法检测40尾人工感染罗非鱼样本和22尾临床上收集的疑似无乳链球菌感染鱼样本。结果表明,所建立的三重PCR方法具有良好特异性,检测无乳链球菌DNA样本时出现三条扩增条带,检测其他7种供试菌株DNA则不出现出任何扩增条带,对无乳链球菌DNA样本的最低检测浓度为0.32ng/μl,最适Mg2+浓度为37.5mmol/L,整个检测过程耗时100min左右。40尾人工感染罗非鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率分别为100%,22尾疑似无乳链球菌感染鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率分别为72.7%,以上两批样本检测结果与常规细菌鉴定方法结果一致。     

海豚链球菌3种免疫原对牙鲆血细胞吞噬及SOD、POD和ACP活力的影响

本文制备海豚链球菌(Streptococcus iniae)强毒株NUF849的福尔马林灭活全菌(FKC)、胞外产物(ECPs)以及全菌与胞外产物的混合物(FKC+ ECPs)3种免疫原,以其免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus),并在免疫牙鲆后第42天分别以海豚链球菌NUF849和NUF812攻毒.在免疫牙鲆后第7、14、21、28、35、42天及攻毒后第7天分别取样,测定血细胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)的活力,以比较3种免疫原对这些免疫指标的影响.结果显示,免疫后尤其攻毒后,红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等的吞噬率与吞噬指数均上升,FKC+ ECPs组显著高于其他组(P＜0.05);各免疫组SOD活力随时间延长而下降并趋于稳定,攻毒后各组数值有不同程度的升高,但FKC+ ECPs组数值最低;免疫组POD活力先升高,第28天起下降,攻毒后各组均下降,FKC+ ECPs组始终高于其他免疫组(P＜0.05);免疫组ACP活力也在免疫后第28天达到峰值,以某株NUF849攻毒后FKC+ ECPs组水平上升(相对于免疫后第42天),其他组显著下降;FKC、ECPs、FKC+ ECPs对菌株NUF849的相对免疫保护宰分别为50％、40％和90％,对NUF812的相对免疫保护率分别为60％、30％和80％,FKC+ ECPs组显著高于其他组(P＜0.05).以上研究表明,各免疫组均诱导了牙鲆的非特异性免疫应答,具有一定的免疫保护效果,其中FKC+ECPs组效果最佳.     

鱼源无乳链球菌致病机理研究进展

从无乳链球菌的感染与传播途径,引起的病理学变化,致病机制,毒力因子和理化因子的影响等5个方面对鱼源无乳链球菌的致病机理作一综述。     

Variation in the immunoglobulin levels in turbot （Scophthalmus maximus） after vaccination with Streptococcus iniae

A pathogenic bacterium(S636),identified as Streptococcus iniae,was isolated from turbot(Scophthalmus maximus) in 2005.We immunized turbot with formalin-killed S.iniae four times(on days 1,14,21,and 28) by intraperitoneal inoculation.After each vaccination,we obtained serum samples and isolated the lymphocytes from the peripheral blood,spleen,pronephros,and mesonephros.We measured surface Ig-positive(sIg+) lymphocytes and serum antibody levels from these organs using flow cytometry and enzyme-linked immunoso...     

罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）Sip基因的克隆、鉴定及分子特性分析

利用设计的特异性引物,扩增出了分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株Sip基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切（BamHⅠ＋HindⅢ）鉴定,并利用多种生物信息学软件对Sip基因进行分子特性分析。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌Sip编码氨基酸序列具有极高保守性,与人源、哺乳动物源无乳链球菌...     

尼罗罗非鱼pik3r1基因的克隆和mRNA表达分析

【目的】哺乳动物pik3r1基因参与多种免疫途径,探索pik3r1基因在罗非鱼(Oreochromis)中的作用。【方法】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)pik3r1(命名为On-pik3r1)cDNA全长,对该基因进行生物信息学分析,并运用荧光定量PCR方法分析无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)刺激后On-pik3r1 mRNA在各组织种的表达模式。【结果与结论】On-pik3r1基因编码区2190 bp,编码729个氨基酸,5′端非编码区(UTR)为542 bp,3′UTR为2248 bp,理论分子质量为83.99 ku,等电点为5.73。On-pik3r1与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)相似性最高(98.53%),与其他物种的同源性在70%以上,表明pik3r1在物种进化过程中高度保守。On-pik3r1在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,其次是鳃、皮肤,在胸腺中表达量最低。经灭活无乳链球菌刺激后,On-pik3r1表达量在肠道、鳃、脾脏、头肾、脑部等5个组织中均极显著下调(P<0.01),在胸腺中表现为4 h时极显著下调(P<0.01),24、48、72 h时为显著下调(P<0.05)。On-pik3r1参与了罗非鱼的对无乳链球菌的免疫应答过程。     

罗非鱼源无乳链球菌培养基及培养条件的优化

研究无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQGY08的培养与生长特性,探讨脑心浸液(Brian Heart Infusion,BHI)培养基的营养因子、初始pH值、溶氧、温度等因素对无乳链球菌生长的影响,并采用正交实验法对无乳链球菌培养基营养因子添加量进行优化。结果表明,无乳链球菌生长的最适初始pH为7～8,培养温度为28～37℃,振荡转速为180～200 r/min。在BHI培养基中添加20 mg/mL的酵母粉和2 mg/mL的葡萄糖即可在对数期获得最大细菌量。