新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF162蛋白的表达、纯化及抗体制备

将新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的ORF162的开放式阅读框插入pET-32a表达载体T7启动子控制下的6-His·Tag编码基因上游,构建SGIVORF162原核表达质粒pET-ORF162。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达SGIV ORF162融合蛋白。对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件进行优化后,确定在0.7mmol/LIPTG、16℃条件下诱导14h时可溶性SGIV ORF162重组蛋白占重组蛋白总量的95%。经镍琼脂糖凝胶纯化,获得纯度为90%以上的SGIV ORF162蛋白。用纯化的SGIV ORF162蛋白免疫小鼠,获得高效特异的SGIV ORF162多克隆抗体。     

石斑鱼虹彩病毒SGIV在宿主细胞内依赖微管运动的行为特征

病毒是非常微小的简单生物, 不能独立生存, 必须借助宿主细胞完成自身的繁衍。病毒侵染进入细胞后, 通常借助于微管通过黏稠的细胞质运动到特定的复制位点。然而, 有关病毒依赖微管运动行为的精细动态研究还比较少。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)为虹彩病毒科蛙病毒属的一个新种, 是海水养殖鱼类的重要病毒性病原, 对海水养殖业造成重大经济损失。利用单粒子示踪技术实时追踪了SGIV病毒粒子沿微管运动的行为, 观察到SGIV在细胞边缘至微管中心之间的双向运动, 最高瞬时速度约0.2μm·s^-1, 均表现为主动运输。病毒粒子运动至微管交叉位置会减速迂回, 而后或受限于此, 平均运动速率约0.008μm·s^-1, 或通过交叉处继续快速运动, 最高瞬时速度为0.2μm·s^-1。同时, SGIV感染会影响微管的形态结构, 随着SGIV感染, 微管逐渐围绕细胞核和病毒加工厂形成环状结构。研究结果初步揭示了SGIV病毒和细胞微管之间相互作用的复杂过程, 丰富了我们对虹彩病毒胞内生命活动的认识, 有助于深入地理解海水鱼类虹彩病毒感染致病机理。     

抗大口黑鲈(Micropterus salmoides)蛙虹彩病毒药效模型的构建及其抗病毒中药筛选

大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)是一种严重危害大口黑鲈养殖的病害,但目前缺乏有效的防控手段。通过研究水温、鱼体大小以及攻毒剂量等条件对大口黑鲈感染蛙虹彩病毒的影响,构建体内抗病毒药效筛选模型,同时利用MTT法构建体外药物筛选模型,进而通过体外和体内药效模型,对29种中草药进行抗病毒药效评价,对筛选出药效最佳的2种中药进行体外和体内抗病毒药效评价。结果表明:水温和鱼体大小是影响体内药效模型的2个关键因子,最佳体内药效模型条件为:水温为25℃,鱼体大小20g,攻毒剂量为0.1mL 10^9.33 TCID₅₀/mL。结合体内和体外药效模型结果,筛选出紫花地丁和黄连这2种中药具有较好的抗病毒效果的中草药。体内药效结果表明:黄连和地丁的添加量为0.6g/kg和1.2g/kg时,其对大口黑鲈的保护率最高均达到40%,而两者用药后病毒在肝组织的抑制率分别可达71.5%和67.0%。组织病理学结果表明,当药物使用浓度为0.6g/kg和1.2g/kg时,可有效降低因大口黑鲈蛙虹彩病毒感染所导致的肝和肾等组织的病理学损伤。上述结果表明,黄连和地丁均具有较好的抗蛙虹彩病毒的作用。     

一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定

2018年7月,浙江省某大口黑鲈(Micropterus salmoides)养殖场暴发疑似病毒引起的疾病。现场采样发现,病鱼体长约15—20cm,鱼体于水面下暗游,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究通过采用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大口黑鲈中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大口黑鲈虹彩病毒宁波分离株(LMBIV-NB001)。EPC经患病鱼组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的EPC细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,EPC细胞质中存在大量直径约120nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鱼组织样本进行PCR扩增,获得了1029bp的目的基因片段。将该扩增片段连入pMD19-T simple质粒后测序,经BLAST比对分析显示,其与GenBank中已报道的鳜鱼蛙病毒NH-1609、大口黑鲈溃疡综合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP基因同源性最高,相似度均达到99.13%。构建系统进化树分析表明,本研究分离的LMBIV-NB001株与NC_038508、GU256635、MG941005等虹彩病毒科蛙病毒属毒株聚成一簇。本论文研究结果为不同地区蛙病毒属成员的起源和分化等相关研究等提供了基础材料。     

虹彩病毒在海水鱼类间感染的研究

本研究通过对人工养殖的真鲷、石鲷进行虹彩病毒人工感染实验，结果表明：随感染时间的推移，被感染鱼的脾脏中病毒感染细胞和吞噬细胞群数量增多；利用虹彩病毒感染的真鲷脾脏分离提纯的病毒悬液，可在真鲷、石鲷等鱼种间交叉感染；病毒悬液由尾柄血管注射比由腹腔注射，感染快、程度严重；较小鱼体有易被病毒感染的趋势；病毒悬液注射量增多，被病毒感染趋强；脾脏、肾脏和肝脏提取的病毒悬液，具较强的感染力。     

虹彩病毒生物学研究现状及展望

20世纪80年代以来,我国水产业迅速发展,在农业产值中所占的比重逐年上升,已成为我国大农业的四大支柱产业(粮食、肉类、水产和禽蛋)之一.2001年我国水产品年产量已达4 380万t,2002年达4 513万t,连续几年居世界第一位.但令人遗憾的是水生动物疾病,尤其是因病毒引起的爆发性流行病明显增多,危害极为严重[1～4].     

流行性造血器官坏死病毒（EHNV）PCR快速检测试剂盒的研制

以流行性造血器官坏死病毒（EHNV）中的主衣壳蛋白基因保守区序列作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,应用快速的模板制备方法和优化PCR扩增条件,建立了EHNV病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒.该试剂盒的检测灵敏度相当于31个病毒粒子,模板制备时间约30 min,约4 h即可得到准确的结果;且无非特异性扩增带,适用于由EHNV病毒感染的鱼类苗种和水产品的检疫及水质环境的监测.     

虹彩病毒生物学研究现状及展望

20世纪80年代以来，我国水产业迅速发展，在农业产值中所占的比重逐年上升，已成为我国大农业的四大支柱产业(粮食、肉类、水产和禽蛋)之一。2001年我国水产品年产量已达4380万t，2002年达4513万t，连续几年居世界第一位。但令人遗憾的是水生动物疾病，尤其是因病毒引起的爆发性流行病明显增多，危害极为严重。     

大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究

探讨大菱鲆病毒疫苗的研制,以牙鲆鳃细胞(FG细胞)为增殖体系,利用细胞病变效应(CPE)为判断指标,对大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)的体外最适增殖条件等进行了研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件对TRBIV的体外增殖均有明显的影响,以0.2 mL病毒液接种FG细胞、吸附2 h、用含10%胎牛血清的MEM培养液于22℃培养时,病毒的增殖速度最快。研究还发现,病毒的收获时间和病毒液冻融次数对所得病毒的感染力均有显著影响,在最佳增殖条件下,病毒在FG细胞中增殖至第4天时进行收获,且只冻融1次,其感染活性最强,反复冻融后病毒的感染活性会显著降低。     

红螯螯虾虹彩病毒在两种螃蟹内的研究

最近报道从患病的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)中分离出一种新的虹彩病毒,被暂时命名为红螯螯虾虹彩病毒.它还能感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),为了探究红螯螯虾虹彩病毒是否能够感染同属于甲壳纲、十足目的螃蟹.选取中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)作为实验对象,应用实时荧光定量PCR技术和透射电子显微镜技术,结论证明了红螯螯虾虹彩病毒能够感染中华绒鳌蟹和粗腿厚纹蟹.推测其他蟹类也可能是其潜在的宿主,这暗示着红螯螯虾虹彩病毒对螃蟹的养殖是一种潜在的威胁.