Identification of Perkinsus-like parasite in Manila clam, Ruditapes philippinarum using DNA molecular marker at ITS region

Genomic DNA was extracted from hypnospores of Perkinsus-like parasite of Manila clam Ruditapes philippinarum collected at the fishing grounds in Huanghai Sea coast Shicheng Island and East China Sea coast Ningbo, China. The internal transcribed spacer（ITS） in rDNA was PCR-amplified, cloned, sequenced, and compared with that of five Perkinsus species in GenBank. The fragment amplified from DNA of parasite of either Shicheng Island or Ningbo contained 649 bp, including partial ssrRNA（51 bp） and ITS（＋5.8 S） （598 bp） regions. The ITS（＋5.SS） sequences of Perkinsus-like parasite of both Shicheng Island and Ningbo were all 99% identical to those ofPerkinsis atlanticus, and were not more than 95% identical to those of other four Perkinsus species including P. marinus, P. andrewsi, P. qugwadi and P. medierraneus.The ITS （＋5.8S） sequence of Perkinsus-like parasite of Shicheng Island was 99% identical to that of Ningbo. These facts about nucleotide sequences suggested that the Perkinsus-like parasite in Manila clam, Ruditapes philippinarum collected from either the Huanghai Sea coast or the East China Sea coast was P. atlanticus, and might reflect P. atlanticus strains of distinct geographic distribution.     

同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法

根据包纳米虫（Bonamia sp.）SSU rDNA和派琴虫（Perkinsus sp.）ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫（Haplosporidium nelsoni）、沿岸单孢子虫（H.costale）等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰爱德华氏菌（E.ictaluri）等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域.     

北黄海菲律宾蛤仔帕金虫汉行病害的研究

2000年7月－11月，对我国北黄海沿岸滩涂增养殖的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum大规模死亡进行了研究，并对病害暴发与温度、盐度的相关性进行了探讨。利用FTM培养和组织切片方法对病害流行海域的菲律宾蛤仔进行了检测。结果表明，蛤仔体内寄生了大量病原帕金虫Perkinsus sp，感染率为20％－100％，感染强度为3－3565936cell/ind或2－1670615cell/g组织。感染强度与蛤仔大小有关，个体越小，感染程度越轻。经感染试验，进一步确定了帕金虫大量繁殖是引起蛤仔大规模死亡的原因。病害始于7月下旬，止于10月下旬；最初暴发于庄河栗子房海域，尔后逐渐向东西两侧海域蔓延。病害暴发时要主要受温度影响，高于20℃易于暴发帕金虫病害；流行范围主要受盐度影响，盐度为20－32海域适宜帕金虫病害的流行。     

几种物理因素对北海派琴虫体外培养方法优化的影响

为缩短传统体外培养派琴虫的生长周期(20 d),以北海派琴虫(Perkinsus beihaiensis)为培养对象,探讨了温度、盐度、震荡条件这3种物理因素单独或协同变化下对北海派琴虫的生活史和培养速率的影响。结果显示,在北海派琴虫经过休眠孢子阶段之后,出现一个前游动孢子囊阶段,该阶段以出芽增殖的方式繁殖,繁殖速度十分迅速,但细胞体积较小。体外培养过程中,单一的温度、盐度条件变化对北海派琴虫的培养速率无显著影响,当只添加震荡条件时,北海派琴虫12d即完成增殖,扩增时间明显缩短、培养速率明显提高。当多个培养条件协同变化下,即温度由35℃降至28℃、盐度35降至25时,北海派琴虫8 d即能完成一个增殖循环,与传统培养方法所需的20 d培养周期相比,大大缩减了培养时间,提高了培养速率。