孔鳐胰脏单层细胞的制备和外源基因的表达

采用机械法、酶消化法和灌注冷消化结合机械法对孔鳐胰脏细胞进行分散,并以台盼蓝染色法测定活细胞率,评价细胞分散后的生长状态.在细胞分散后对孔鳐胰脏细胞用腺病毒载体和阳离子多聚物进行外源基因的转染.实验结果表明,灌注冷消化结合机械法可以获得较高的活细胞率,胰脏细胞可以正常生长并表达外源基因.     

三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）对大菱鲆（Scophthalmus maximus）免疫相关基因表达的影响

三（2-氯乙基）磷酸酯（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP）是一种新型内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs),低剂量就会造成很强的生物毒性。通过研究不同质量浓度梯度的TCEP对养殖大菱鲆的胁迫,发现其在24 h 、48 h 、72 h 和96 h的半致死浓度（LC₅₀）分别为190.76 mg/L、159.94 mg/L、140.70 mg/L和110.71 mg/L;安全浓度（SC）为33.60 mg/L。24 h内不同质量浓度梯度的TCEP和不同胁迫时间对养殖大菱鲆的影响表明,高于质量浓度33.60 mg/L的TCEP对大菱鲆具有急性毒性效应。用实时荧光定量PCR技术分析TCEP急性胁迫的养殖大菱鲆体内2种细胞免疫因子-组织相容性复合体alpha（MHC-Ⅱ α）和肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）的基因相对表达水平,发现经TCEP胁迫后2种细胞免疫因子的表达量都显著上调;随TCEP的质量浓度升高,特别是达到47.69 mg/L（$ \frac{1}{4} $ LC₅₀）以上时表达量的变化更加明显;而胁迫时间超过12 h,基因表达量会呈现先上升后下降的趋势,说明对大菱鲆免疫系统造成急性损伤。研究结果可为大菱鲆健康养殖提供参考,并为环境污染物检测提供分子标记参考。     

Characterization of SNAP-25 gene from marine teleostean, Lateolabrax japonicus

The t-SNARE protein SNAP-25 (synaptosome-associated protein of 25 kDa) plays an essential role in regulating fusion between the vesicle and plasma membranes during exocytosis. To clone and characterize SNAP-25 gene, the first step in the functional study of SNARE proteins in marine teleostean, was to obtain the cDNA of sea perch SNAP-25 (SPsn25) by RT-PCR and RACE-PCR amplification of a Japanese sea perch. The full-length cDNA of 831bp contains a CDS of 615 bp, coding 204 amino acid residues, and a 5′UTR of 219bp. Bioinformatic analysis revealed that SPsn25 corresponds with SNAP-25a isoform and shares 91.1% identity with SNAP-25a of a goldfish and a zebrafish. The SPsn25 expression in both mRNA and protein levels in the Japanese sea perch had been identified through semi-quantitative RT-PCR and Western Blot assay. Together, these data again confirmed the nerve tissue specificity of the fish SNAP-25 gene expression.     

VAMP-2在鲈鱼组织中的表达分布

VAMP-2是真核生物中的一种膜受体蛋白,该蛋白在真核生物的胞吐、信号传导、胞内运输和分泌等活动中起到重要作用.采用免疫印迹方法和原位杂交技术,研究了VAMP-2在鲈鱼组织中的表达情况,分别对鲈鱼8种组织中的VAMP-2进行了检测.结果表明,除脑组织外,在肠、肝脏、肾脏、皮肤、脾脏、性腺等组织中也检测到VAMP-2的表达,各组织间的表达水平亦存在差异,肌肉组织未检测到表达.研究表明,鲈鱼的组织中表达的VAMP-2蛋白可能广泛参与鲈鱼的各种生理活动,并影响其生长、发育、繁殖和防卫等各项重要的生物学功能.     

松江鲈肌酸激酶的基因克隆、表达与功能分析

前期蛋白质质谱分析发现,松江鲈（Trachidermus fasciatus Heckel）经鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激后,其皮肤黏液中的肌酸激酶（creatine kinase,CK）的表达明显上调。目前,肌酸激酶在鱼类中的功能研究尚未深入开展。本文利用RACE技术克隆获得了松江鲈CK基因的全长cDNA序列（命名为TfM-CK）。TfM-CK基因的cDNA全长为1 474 bp,开放阅读框为1 146 bp,编码381个氨基酸。序列比对分析显示,TfM-CK序列高度保守。实时荧光定量PCR显示,TfM-CK mRNA广泛表达于松江鲈各组织,在肌肉中的相对表达量最高,其次为血液。鳗弧菌刺激后,TfM-CK mRNA在肌肉、皮肤、脾脏和头肾中均上调表达。其中,脾脏中的表达量高达对照组的900多倍。原核重组表达纯化的TfM-CK （rTfM-CK）蛋白酶活测定实验结果显示,重组蛋白的酶活为22.0 U/mg。rTfM-CK对鳗弧菌、大肠杆菌（Escherichia coli）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有较强的凝集作用。由以上实验结果推测,TfM-CK可能通过细菌凝集作用参与到了松江鲈抵抗病原菌的先天免疫防御过程中。本研究为认识鱼类肌酸激酶的功能及其在病原菌防御过程中的分子免疫机制机制提供了参考。     

膜片钳技术在海洋鱼类研究中的应用与展望

膜片钳技术是1种先进的电生理技术,通过该技术研究海洋鱼类的电生理活动,可以在细胞和分子水平上揭示鱼类某些重要的生理功能。文中简要介绍了膜片钳技术的基本原理,回顾了国内外应用膜片钳技术研究离子通道在鱼类中枢神经元功能、渗透压调节和心脏功能调节方面的作用。展望了该项技术在研究海洋鱼类生长发育、生殖和免疫防御方面的应用前景。