泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究

通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。     

采用SDS研究泥蚶血红蛋白(Tg-HbⅡ)具有过氧化物酶及抗菌活性的结构基础

泥蚶血红蛋白(Tg-HbⅡ)除了具有携氧功能外,还具有过氧化物酶活性和抗菌活性。本文采用分光光度法、光谱法和分子对接等技术研究了十二烷基硫酸钠(SDS)对Tg-HbⅡ的结构、过氧化物酶活性及抗菌活性的影响,以探讨Tg-HbⅡ具有过氧化物酶活性及抗菌活性的结构基础。研究结果显示,SDS的疏水烷基长链可嵌入到Tg-HbⅡ血红素口袋内部,与近端His104形成氢键,断裂血红素铁与His104的配位键,使Tg-HbⅡ的Soret带吸收峰降低并发生位移;此外,SDS还可与血红素口袋中的氨基酸形成疏水相互作用,改变血红素口袋原有结构,使得部分疏水氨基酸暴露,导致外源荧光强度增强,最大发射波长红移。SDS可以抑制Tg-HbⅡ的过氧化物酶活性,当SDS浓度为2 mmol•L^–1时,Tg-HbⅡ的酶活性仅为原来的20%,在琼脂扩散实验中失去对枯草芽孢杆菌的抗菌活性。以上结果表明,SDS通过破坏血红素口袋的内部结构抑制Tg-HbⅡ的过氧化物酶活性,使其失去抗菌活性,血红素疏水口袋是Tg-HbⅡ具有过氧化物酶活性和抗菌活性的关键结构。本研究为进一步研究Tg-HbⅡ的抗菌机理奠定基础。     

基于CO1基因的渔山列岛厚壳贻贝遗传资源评估

基于线粒体CO1基因的序列,对渔山列岛,大连獐子岛,南麂列岛,山东南隍城乡,舟山嵊泗5个野生群体的厚壳贻贝进行遗传多样性和遗传结构的分析。结果表明:在mt DNACO1基因同源片段上共检测到了39个多态位点,其中39个简约信息位点,无单突变位点,构成40个单倍型,群体遗传多样性水平为:渔山山东大连舟山南麂;然而单倍型多样性却是山东渔山南麂大连舟山。分子进化树和单倍型网络关系图构建结果显示:5个群体之间分为3个单倍型类群(A、B、C),其中A类群含15个单倍型,B类群含23个单倍型,C类群含2个单倍型(均为渔山列岛的单倍型),其中渔山列岛的单倍型在上述三个类群中都有分布。3个单倍型类群间的遗传距离为0.0099~0.0268。渔山列岛群体内遗传分化较为显著,其他4个群体间未检测到显著的遗传分化。     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

5种水产动物血红细胞形态显微观察比较及进化分析

采用Hemacolor染料对泥蚶（Tegillarca granosa）、毛蚶（Scapharca subcrenata）、鲫鱼（Carassiusauranus）、牛蛙（Rana catesbeiana）、中华鳖（Pelodiscus sinensis）等5种水产动物血细胞涂片进行染色,利用光镜和扫描电镜两种方法对5...     

镉诱导缢蛏(Sinonovacula constricta)体内金属硫蛋白基因变化规律研究

采用荧光定量PCR法,研究了缢蛏体内7种组织中金属硫蛋白(MT)mRNA的组织特异性表达,以及不同浓度梯度重金属Cd2+对缢蛏内脏团中MT mRNA的诱导效应。结果表明,在自然状态下,MT mRNA在缢蛏内脏团中的相对表达量最高;在不同浓度重金属Cd2+胁迫条件下,缢蛏内脏团中MT mRNA的诱导表达具有明显的剂量效应和时间效应,即随着Cd2+浓度的增加,MT mRNA的最大表达量明显升高,而随着时间的变化,MT基因的表达呈现脉冲式波动,具有较强的时间依赖性。在3h和48h缢蛏内脏团中MT基因表达量与重金属Cd2+浓度之间具有较好的线性相关性,说明缢蛏内脏团中MT mRNA表达变化可以作为指示环境重金属Cd2+污染的一个生物参考指标。     

菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)对重金属Hg~(2+)的富集及相关生物标记物的识别

以我国近海重要经济贝类菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)为对象,探讨了不同加标浓度Hg2+(2.5、5、7.5、10μg/L)胁迫下菲律宾蛤仔鳃组织的富集效应,测定了鳃和血细胞两个组织中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),细胞色素P450(CYP414A1),硫氧还蛋白(Trx)、金属硫蛋白(MT)、热休克蛋白(HSP70)以及溶菌酶(Lysozyme)8个基因的剂量和时序表达变化,筛选了指示汞污染的生物标记物。研究结果表明:蛤仔鳃组织对汞富集随时间延长和Hg2+浓度增加均呈现逐渐上升趋势,在10μg/L Hg2+剂量暴露48 h时达到(0.308±0.037)μg/g的最高富集量,为对照组的21倍(P0.01)。基因表达分析结果显示,鳃CYP414A1和GPx基因分别在24 h和48 h的2.5μg/L暴露组表达显著上调。鳃Lysozyme在24 h的7.5μg/L处理组中表达显著上调,鳃HSP70基因在48 h的7.5μg/L处理组中呈现显著下调趋势(P0.01)。鳃和血细胞中HSP70基因表达量在10μg/L处理组中均极显著高于对照组和其它处理组(P0.01)。鳃CYP414A1和GPx基因、鳃Lysozyme和鳃HSP70、鳃和血细胞HSP70的表达结果可分别作为指示不同浓度汞污染的生物标记物,其它基因的表达结果不符合生物标记物的筛选原则。研究结果表明组合型生物标记物可较有效地反映海洋环境汞污染状况,为利用生物标记物进行重金属Hg污染早期监测方法体系的建立提供了基础的研究资料。     

黄口荔枝螺转录组数据的微卫星标记开发与分析

以黄口荔枝螺转录组测序所得到的拼接序列为基础,利用MISA软件进行微卫星分析,利用Primer5.0设计引物160对。结果显示,83对引物能够成功扩增,引物在黄口荔枝螺渔山列岛群体多态性检测中发现,37个SSR位点能够表现出多态性,一共获得了129个等位基因,各位点等位基因数为2~5个,平均每个位点等位基因数为3.49个,观测杂合度H_o,期望杂合度H_e,多态信息含量PIC范围分别介于0.000~0.800、0.146~0.645、0.139~0.573之间,有9个表现为高度多态,20个表现为中度多态,8个表现为低度多态。实验结果进行Hardy-Weinberg平衡检测后,利用Bonferroni correction法进行校正,有29个位点显著偏离,结果表明渔山列岛黄口荔枝螺群体总体遗传多样性水平较低。     

中国沿海西施舌5个自然群体形态差异和RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对5个西施舌自然群体的遗传多样性进行了研究.在选择的20个随机引物中共检测到168条标记条带.每个引物扩增谱带数在3～15之间.片段长度250～3 000 bp不等.利用Popgen1.32和PHILIP统计软件对实验数据进行处理,确立了5个群体间的亲缘关系,并对3个形态参数进行了方差分析,探讨了与RAPD结果的关联.结果表明:5个群体内和群体间遗传距离都较大,广西北海群体由于地理环境等因素的影响,无论是外部形态和遗传距离与其他4群体有较大差异,可能已经形成了地理种群.5个群体多态位点比例和平均遗传杂合度都较高,平均值为78.97%和0.308 7,香农多样值在0.301 8～0.367 3之间,聚类分析显示,山东群体与江苏群体亲缘关系最近,然后依次是浙江群体和福建群体.我国西施舌遗传多样性处于较高的水平,种质资源良好,西施舌养殖有很好的发展前景.     

贝类同工酶技术的应用研究进展

对近年来同工酶技术在贝类个体发育、组织特异性、亲缘鉴定、形态分类、群体遗传及生理病理诊断等方面的应用研究进行了系统总结和综合评述,为今后进一步开展研究贝类的生物遗传和养殖生产提供参考。