麻痹性贝毒毒素研究Ⅰ.塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒毒素对运动神经末梢和全细胞钠离子通道的抑制作用研究

麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)毒素由石房蛤毒素(saxitoxin,STX)及其衍生物组成,目前己发现20余种,在赤潮研究、分子生物学和神经生物学基础研究、医药、军事防化等方面都有应用潜力[其结构、类型和应用见本集刊王云峰等(2003)“麻痹性贝毒毒素的应用研究进展”一文]。由于PSP毒素的稀有来源和国际社会对STX交易的禁止,限制了国内PSP毒素应用及研究的全面深入展开,因此本文作者对PSP毒素进行了制备,并采用不同方法对制备的PSP毒素进行了研究。PSP毒素能够选择性地可逆抑制可兴奋膜的电压依赖钠离子通道的开放,从而阻止神经冲动的发生和传导,使神经、肌肉丧失兴奋性(Frace et al.,1986;Penzotti et al.,1998)。本文利用神经束膜下记录和全细胞膜片钳技术,报道了从塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)中提取的PSP粗毒素对小鼠运动神经末梢膜电流和NG108-15细胞钠离子通道的作用研究结果,并与STX标准毒素的作用结果进行了比较。NG108-15细胞是由小鼠神经母细胞瘤和大鼠胶质细胞瘤融合的杂交细胞,经分化剂分化后,显示诸+L1196如兴奋性、合成和释放乙酰胆碱、与培养肌细胞形成突触联系等多种神经细胞的基本特性(Hamprcht,1977)和Na+、K+、Ca2+等多种离子通道,已作为神经细胞模型被广泛应用于分析药物对离子通道作用的研究(Enomoto et al.,1992; Docherty et al.,1992;Shi et al.,1993;Hu et al.,1997a;Hu et al.,1997b);发育出具有Na+内流支持的锋电位(Hamprecht,1977),该电位是分析作用于膜钠离子通道药物的好材料。     

强壮前沟藻(Amphidinium carterae Hulburt)毒素的溶血活性研究

以实验室单种培养的强壮前沟藻为对象,研究了强壮前沟藻毒素的来源,分析了藻毒素浓度与溶血活性的相关性,研究了理化因子对藻毒素溶血活性的影响。结果表明,溶血活性随着强壮前沟藻细胞的增殖呈上升的趋势,细胞内容物和细胞碎片的溶血活性显著高于去藻过滤液,强壮前沟藻毒素主要来源于衰亡期的细胞内容物和细胞碎片,并存在浓度相关的溶血性。强壮前沟藻毒素的溶血活性不存在光敏感性。随着pH的上升,毒素溶血活性呈降低趋势。Ca2+、Mn2+、Cu2+抑制了强壮前沟藻毒素溶血活性,而Co2+、Zn2+显著的增强了溶血活性,Mg2+对其溶血活性的影响不显著。EDTA对强壮前沟藻毒素的溶血活性有显著的促进作用。     

广东沿海牡蛎体的麻痹性毒素与评价

根据１９９０～１９９７年间广东沿海１７年采样点的牡蛎体的麻痹性素检测数据,阐述了广东沿海三个岸段牡蛎体中的麻痹性毒素的含量水平、地理分布、季节差异以及麻痹性毒素在牡蛎体中的分布。为我国沿海麻痹性贝类毒素中毒事件的防治提供基础数据。     

滇池铜绿微囊藻(M. aeruginosa Kutz)的分离培养与总DNA提取的改进

利用稀释法结合平板分离培养法将采用滇池水华中的铜绿微囊灌进行了成功的分离纯化,对比纯化培养前后,发现纯化后该藻的生长速度明显加快,密度大为提高,约为纯化前的5倍,由乙醇乙醚混合液对该灌作预处理后,破坏了其胶质被,再经常规方法提取总DNA,其得率提高3－4倍。     

腹泻性贝毒的高效液相色谱法测定条件改进及其运用

对腹泻性贝毒的高效液相色谱测定方法的条件进行改变，使原来对实验条件要求苛刻的方法更适宜于一般的实验室使用，使其有可能替代国内目前常用的小鼠生物方法。井成功地运用于冬季大连海域贝类腹泻性贝毒的检测，首次报道了大连地区海域贝类腹泻性贝毒的主要成分大田软海绵酸的含量，其结果是2000年1—3月大连地区海域贝类腹泻性贝毒除个别海区外一般都末检出。     

淡水蓝藻毒素研究概况

一些易形成水华或浮渣的有毒蓝藻品系在组成上占优势,产生的毒素超过了敏感动物的耐受阀值时,即可能造成大量的家畜、野生动物或鱼类中毒死亡。目前已知淡水蓝藻毒素主要为生物碱、多肽、蝶啶类或脂多糖,但新的有毒品系产生的新毒素不断被发现,毒素结构也研究得越来越清楚。淡水蓝藻水华还能引起过敏反应以及在供水过程中导致人类胃肠炎突然蔓延。     

霞水母刺丝囊毒素溶血活性的稳定性研究

从霞水母Cyanea sp.中分离刺丝囊,提取刺丝囊毒素(NV),并研究了温度、pH和几种化学组分对其溶血活性稳定性的影响.实验结果表明,在4～37℃范围内NV的溶血活性与温度变化密切相关,毒素在4℃以下几乎没有发生溶血反应,在37℃以下反应45 min以后,溶血活性达到最大值;毒素的溶血活性对pH敏感,在pH 7.8时.溶血活性最强,溶血率为93.53%.EDTA、NaCl和还原型谷胱甘肽(GSH)对NV溶血活性都具有稳定作用.通过正交实验发现,GSH对溶血活性的影响最大,当提取液中含有1.0 mmol/L GSH和5.0 mmol/L NaCl时毒素的溶血活性最强.DTT(二硫苏糖醇)明显降低毒素的溶血活性,说明毒素中溶血蛋白的活性很可能与分布在蛋白质表面的二硫键有关.Ca2+虽然能够增强毒素的溶血活性但是对毒素并没有稳定作用,所以Ca2+可能只是毒素溶血活性的活化剂.甘油对毒素的稳定作用不明显.     

微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)的氮磷吸收、生长、产毒动态变化

采用浮游植物计数法、高效液相色谱串联质谱法、分光光度法等分析方法,探索了微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)在批次培养过程中氮磷吸收、产毒、生物量、p H等参数的动态变化关系。结果表明,微小亚历山大藻对磷的吸收迅速,可以将磷储存于体内,待生长使用。该藻对氮的吸收相对缓慢,环境中氮缺乏时,产毒量不再增加,说明氮对产毒有着重要的调控作用。在第二对数期中出现了碳限制环境,导致叶绿素a在碳限制条件下无法表征藻的生物量,相反,叶绿素a和生物量呈负线性关系,可能是叶绿素转化成其它含碳物质,用于生长。毒素不仅存在于细胞体内,培养液中(胞外)也含有毒素,并且胞外毒素从稳定期开始逐渐升高。胞内毒素的组成中GTX1/4占据绝对优势,GTX2/3含量相对较少。生长延缓期和第一对数期,各种毒素组成比例相对稳定,而在随后的生长期内,GTX1/4在总毒素中的占比逐渐上升,GTX2/3占比逐渐下降,表明微小亚历山大藻毒素组成会随着生长周期的变化而发生变化。     

无磷条件诱导铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)释放挥发性有机化合物对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的影响

为了揭示磷(P)营养缺乏对蓝藻释放挥发性有机化合物(VOCs)的影响及其对其他藻类的化感作用,以形成蓝藻水华的主要种类铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)为材料,在无P培养条件下对其释放的VOCs进行分析,同时测定VOCs对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)生长、光合色素含量和光合性能的影响.结果表明,采用无P培养基培养铜绿微囊藻24 h后,其释放的VOCs种类和含量均明显增加,与标准培养基培养相比,VOCs总释放量增加了73.4%,并出现7种新化合物.将铜绿微囊藻释放的VOCs通入莱茵衣藻溶液中,在标准培养基中铜绿微囊藻释放的VOCs对莱茵衣藻生长无显著影响,而无P条件下释放的VOCs则明显抑制莱茵衣藻生长,其响应指数(RI)为-0.25.此外,莱茵衣藻光合色素含量、光系统II(PSII)最大光化学量子产量(Fv/Fm)、有效光化学量子产量[Y(II)]、光化学淬灭系数(q P)和光合电子传递速率(ETR)也明显降低,而非光化学淬灭系数(NPQ)则明显升高,其RI为0.26.由此可见,蓝藻在富营养化水体中大量繁殖以及P自身沉降特性导致的P缺乏会促进蓝藻释放VOCs,同时这些VOCs在保持蓝藻营养竞争优势和水体藻类多样性减少中具有化感抑制作用.     

波吉卵囊藻胞外滤液对铜绿微囊藻转录水平的影响

【目的】探索波吉卵囊藻胞外滤液对铜绿微囊藻的抑制机理。【方法】采用Illumina平台,对使用BG11培养基(对照组)和波吉卵囊藻胞外滤液(实验组)培养的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行通路富集分析,并对部分差异表达基因进行qRT-PCR验证。【结果】与对照组相比,波吉卵囊藻胞外滤液处理后的铜绿微囊藻组中筛选1483个表达差异显著的基因,其中上调表达基因788个,下调表达基因695个。GO功能分析将差异基因划分为35个子类别,包括催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、膜、膜部分等。KEGG通路分析中,所有差异基因聚集在108个通路,其中84个差异基因注释在代谢功能类别中,而氧化磷酸化通路富集最显著。氧化磷酸化通路中,相关基因表达以上调为主(26个DEGs,20个上调,6个下调)。qRT-PCR验证结果与转录组测序结果的表达变化趋势一致。【结论】波吉卵囊藻滤液引起铜绿微囊藻氧化磷酸化途径上基因表达上调,ATP合成效率提高。