文蛤C型凝集素基因(Mm-Lec1)的克隆与表达分析

文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的滩涂养殖贝类,病害严重影响文蛤增养殖业,研究文蛤的免疫机制有助于解决文蛤的病害问题。C型凝集素(C-type lectin)参与先天免疫,在识别病原相关分子模式和激活体液免疫因子等方面发挥重要作用。本研究检索已构建的文蛤全长cDNA 文库,经过Blast比对得到了文蛤C型凝集素1(Mm-Lec1)基因的全长cDNA序列。Mm-Lec1序列全长586 bp,5'和3'非翻译区(UTR)的长度分别为21 bp和79 bp,开放阅读框长度为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.65 kD,理论等电点为4.98。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met1-Ser19)、糖识别结构域(CRD)和糖结合位点(QPN)。Mm-Lec1的三级结构是紧凑型,含有β片层结构。同源性分析结果表明,Mm-Lec1与其他物种C型凝集素相似度在20%~32%;邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进化树分析结果表明,Mm-Lec1与紫贻贝CTL 6和栉孔扇贝CTL A聚为一支。实时荧光定量分析结果显示,Mm-Lec1在文蛤鳃、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、性腺和血细胞中均表达,其中鳃表达量最高,血细胞次之,性腺中表达量最少;在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激实验中,6 h时Mm-Lec1在血细胞中的表达量最低,48 h表达量最高,暗示Mm-Lec1参与文蛤抵御细菌入侵的免疫过程。     

刺参PDRG基因全长克隆及其夏眠期间在消化道中的表达特征

夏眠是刺参的重要生理特征; 夏眠期间, 刺参体重明显减轻, 器官萎缩、退化, 其中消化道退化明显。PDRG(p53 and DNA damage-regulated gene)是近年来研究发现与细胞凋亡具有密切联系的基因,其表达可促进细胞凋亡。本研究利用SMART RACE 技术克隆获得刺参PDRG 基因的cDNA 全长序列,并以此为基础, 研究刺参夏眠期间PDRG 基因表达与消化道退化的相关性。结果显示, 刺参PDRG 基因cDNA 全长为1122bp, 包含127bp 的5’非翻译区(untranslated region, UTR), 581bp 的3’UTR 和414bp的开放阅读框(open reading frame, ORF); ORF 区编码137 个氨基酸, 推算的分子质量约为16.1kDu, 理论等电点为7.83。研究通过25℃温度诱导刺参进入夏眠, 利用实时定量PCR 方法, 定量检测刺参消化道PDRG 基因表达, 结果表明: 夏眠期间刺参消化道PDRG 基因mRNA 表达水平与对照组相比出现显著上升, 实验5d 时显著上调至约2.49 倍, 10d 时显著上调至约1.51 倍, 而在0、20、40 d 时未检测出显著变化; 与刺参消化道相对质量变化数据结合分析表明, 刺参夏眠期间消化道的PDRG 基因高表达与其萎缩、退化密切相关。本研究阐明刺参夏眠期间消化道组织退化过程中PDRG 基因表达特征, 证明刺参PDRG 基因表达与消化道退化具有相关性, 为进一步探讨PDRG 基因在动物器官退化过程中的功能提供参考依据。     

渤海湾肠道病毒的季节分布及其污染类型分析

肠道病毒是一类水传播胃肠道疾病的重要病原体。为了解感染性肠道病毒在海水环境中的季节分布规律、污染类型以及与流行病学的关系,于2010年12月到2011年10月应用能够提供病毒感染性信息的细胞培养结合实时定量PCR（ICC-qPCR）方法,分4个季节对渤海湾天津近岸海域表层海水中肠道病毒进行了监测。500 mL海水经超滤浓缩,48 h细胞培养,然后用qPCR检测得到四季海水样品中感染性肠道病毒的浓度为0.2~196 PFU/L,平均值为60 PFU/L,其中夏季和秋季肠道病毒浓度较高,其平均值分别为82 PFU/L和110 PFU/L。秋季阳性检出率最高（85.7%）,其次是冬季（71.4%）。经测序分析,其主要污染类型是脊髓灰质炎 Ⅰ 型疫苗株,此外,还检测出危及公众健康的一株类口服脊灰 Ⅰ 型疫苗脊灰和一株脊灰疫苗衍生株。由此可见,肠道病毒的季节分布和主要污染类型与临床上的流行趋势基本一致,海洋作为一个天然的受纳水体为病毒提供了良好的栖息场所和传播机会,对公众健康存在着潜在的威胁。因此,为减少相关疾病的暴发,应重点加强肠道病毒流行季节的海洋水质监测。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) “黄海2号”人工感染WSSV的荧光定量分析

采用人工投喂的方法对人工选育的104个"黄海2号"中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系的5557尾个体[体重(2.1±0.7)g]进行WSSV感染实验,分别选取存活时间最长(342h)和存活时间最短(45h)的48尾个体,定义为抗病组和敏感组。用荧光定量PCR方法检测两组对虾体内WSSV含量,结果表明,抗病组和敏感组对虾体内WSSV含量范围分别为(2.64×104)—(3.13×106)和23.2—1.92×106copies/ngDNA,平均值分别为8.71×105和3.19×105copies/ng DNA,抗病组对虾WSSV含量显著高于敏感组(P<0.05),显示抗病组比敏感组具有更强的抗病性能。对感染测试的所有对虾的死亡情况进行统计分析,结果表明,其死亡曲线不符合数量性状的正态分布特征,提示中国对虾对WSSV的抗性可能由少数几个主基因决定。本研究可为揭示中国对虾抗WSSV性状的基因决定机制提供依据。     

Oceanic circulation in the head of the Hikurangi trench,east coast,New Zealand

The geostrophic flow and direct current measurements in the inflow of the Southland Current into the Hikurangi Trench east of New Zealand confirm the geostrophic circulation pattern previously found. The northwards inflow of the Southland Current at the latitude of the Chatham Rise (44°S) is estimated at 1.7 × 10⁶ m³.s^‐1, which compares favourably with that of 1.2 × 10⁶ m³.s^‐1 calculated previously off Kaikoura.     

Quantitation of metallothionein mRNA from the New Zealand common bully (Gobiomorphus cotidianus) and its implications for biomonitoring

Metallothionein (MT) is a protein found in most eukaryotes where its primary role is the regulation of homeostasis of the essential metals copper and zinc. MTs have an additional protective role through their binding of toxic metals such as cadmium and mercury. Increased expression of MT in response to harmful levels of these metals has been demonstrated for several aquatic species. In this study, the expression of MT in the liver tissue of the New Zealand common bully Gobiomorphus cotidianus was measured by quantifying MT mRNA. A statistically significant increase in MT expression was observed in fish exposed to copper for 48 h, but not those exposed to zinc. Field sampling of common bullies showed a wide variation in individual hepatic MT mRNA levels which did not correlate with fish age, sex, or sampling location. A comparison of two populations of common bullies from a polluted and a control site showed a two‐fold higher mean MT mRNA level in fish from the polluted site. Implications for using MT expression in the common bully as a bio‐monitoring tool are discussed.     

淡水湖泊中类蛭弧菌的分离方法

从贵州阿哈湖、百花湖及云南滇池不同深度的湖水中筛选出2株宿主菌株。经16SrRNA基因序列分析,这2株宿主菌分别鉴定为肠杆菌(Enterobacteriales)和黄色单胞菌(Xanthomonadales)。分别利用这2株宿主菌,从湖水样品中获得到了类蛭弧菌噬菌斑。通过吸光度分析、用淡水类蛭弧菌的特异性引物进行基因扩增、DNA序列分析等一系列方法,证实了所分离的菌株为类蛭弧菌。建立了用同一生长环境中的宿主菌来分离类蛭弧菌的方法,并用该方法从淡水湖泊中分离出了不同类群的类蛭弧菌菌株。     

实时荧光定量PCR检测鳜IgM mRNA标准品质粒的构建

利用SYBR Green I荧光定量PCR技术,建立鳜IgM-DNA定量标准品的制备方法。从浸泡免疫后的鳜头肾中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定。将所得预期质粒梯度稀释后构建标准曲线并进行融解曲线分析。结果表明,当标准品的浓度在3.29×102～3.29×108拷贝/μL时,模板浓度与循环阈值(Ct)间的线性关系良好,相关系数r2达到0.999;融解曲线分析显示具特异的单个峰,表明扩增产物特异性非常好。此法制备的重组质粒标准品可用于对鳜IgM基因的转录水平进行测定。     

抗草甘磷转基因大豆多重PCR检测及假阳性问题探讨

以大豆病基因类似物(RGA)基因为对照,用RR大豆中的外源CaMV35S启动子、CP4-EPSPS引物,应用多重PCR方法,从RR大豆中扩增出预期大小的DNA片段。结果表明:将扩增产物回收后测序,经同源性分析扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS的一部分序列;多重PCR检测的灵敏度为0.08%;PCR检测过程中产生假阳性的原因是污染和非特异性扩增。