纤毛虫单细胞基因组DNA微量提取方法的比较及优化

在纤毛虫的分子生物学研究中,单细胞基因组DNA的微量提取是后续基因分析的关键。本研究以海洋纤毛虫红色伪角毛虫为材料,采用直接取完整虫体、裂解法以及3种改良后的试剂盒微量提取DNA方法,分别提取了新鲜样品与4种不同方法保存样品的基因组DNA,比较了9种组合在PCR产物质量、提取所需时间、成本及便捷性方面的优劣,并进一步比较、讨论和探索了4种样品保存方法和5种DNA微量提取方法在纤毛虫单细胞基因组PCR扩增中的可行性。本工作旨在为后续的纤毛虫分子生物学研究提供可资借鉴的技术路线和方法。     

Seasonal Liza aurata tissue-specific DNA integrity in a multi-contaminated coastal lagoon (Ria de Aveiro, Portugal)

In this study, the DNA integrity of golden grey mullet (Liza aurata) collected in differently contaminated sites of a coastal lagoon, Ria de Aveiro (Portugal), was assessed, over the period of 1 year, using the DNA alkaline unwinding assay, in four different tissues (gill, kidney, liver and blood) and compared to a reference site. The four tissues displayed different DNA integrity basal levels, clearly affected by seasonal factors. Gill and kidney were, respectively, the most and least sensitive tissues. All sites demonstrated the capacity to interfere with DNA integrity. The sites displaying the highest and lowest DNA damage capability were, respectively, Barra (subject to naval traffic) and Vagos (contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons). In terms of seasonal variability, autumn seems to be the more critical season (more DNA damage) unlike summer when no DNA damage was found in any tissue. Data recommend the continued monitoring of this aquatic system.     

用于RAPD分析的沙拐枣DNA提取方法

DNA分子标记技术是检测遗传差异的一种新技术,特别是RAPD技术,应用更为广泛。DNA质量是保证RAPD分析成功的关键。本文用改进的SDS法对沙拐枣属植物种子的总DNA进行了提取。琼脂糖凝胶电泳结果表明:得到的DNA片段大小在20kb以上;通过PCR扩增实验,证明用此方法提取的DNA,可直接用于随机扩增的DNA多态性(RAPD)遗传标记。     

淡水鱼类环境DNA宏条形码引物的筛选及其在千岛湖的应用

基于环境DNA(eDNA)技术的鱼类多样性监测方法因具有灵敏度高、对目标生物无伤害以及成本低等特点,近年来在国内外得到了广泛应用。eDNA方法的有效性往往取决于宏条形码引物的选择,尽管目前已经有一些鱼类环境DNA宏条形码引物,但较少有研究综合评估这些引物的检出效果。本研究评估了来自COI、Cytb、12S rRNA和16S rRNA基因的29对鱼类eDNA宏条形码引物(包括本研究设计的2对和从国内外文献中引用的27对引物),首先基于计算机模拟PCR(in silico PCR)进行了初步分析,随后通过高通量测序对其中效果较好的17对引物开展了更进一步的验证,结果显示:计算机模拟PCR结果良好的引物在进行高通量测序时并非全部表现良好,表明引物的筛选不能仅仅依靠计算机模拟PCR;具有更长扩增片段长度的宏条形码引物并没有获得理想中更好的扩增效果,表现效果好的引物大多是扩增片段长度处于200~300 bp之间的引物;相对于COI和Cytb而言,12S rRNA引物与16S rRNA引物均具有良好的扩增效果,适宜作为鱼类环境DNA宏条形码而用于鱼类多样性研究;同时,鉴于当前的鱼类DNA条形码数据库尚不完备以及不同引物的特性不同,使用多对引物将大大增加物种的检出概率和eDNA研究的可信性。本研究展示了eDNA在评估生物多样性方面的潜力,有助于将来的鱼类eDNA研究,从而为鱼类多样性的保护提供参考。     

基于环境DNA技术的黄河流域下游山区河流大型底栖动物群落多样性特征及其影响要素分析

河流生物群落组成由多种环境因子共同作用形成,但其影响机制尚不清楚。本研究基于环境DNA技术,选择黄河流域下游4条山区河流(锦绣川、锦阳川、锦云川和三川汇合后河流)的10个样点开展大型底栖动物监测。结果发现:不同溪段水质状况有所差异,锦云川盐化程度(以电导率EC表征)和营养盐浓度较高,锦阳川抗生素浓度较高,锦绣川水质较好。山区河流大型底栖动物群落组成差异明显,锦绣川以水生昆虫为主,软体动物占比较低。其中,昆虫纲的大蚊(Tipula abdominalis)、天角蜉(Uracanthella punctisetae)和寡毛纲的顠体虫(Aeolosoma sp.)是造成锦绣川与其他河流大型底栖动物群落结构差异的关键物种。冗余分析和变差分解分析结果表明,盐化、营养盐和抗生素均会对大型底栖动物群落组成产生影响。其中,EC的解释率为22.86%,营养盐中的TP、NH₃-N和TN的解释率分别为20.12%、13.25%和7.81%;此外,盐化可与营养盐和抗生素通过耦合效应对大型底栖动物群落组成产生影响,贡献率分别为21.60%和16.20%;抗生素与营养盐的贡献率为19.60%。逐步判别回归模型结果显示,Margalef指数(d)受盐化(EC)和营养盐(NH₃-N和NO₃^--N)的共同影响;随着河流中EC浓度升高,d 与NH₃-N之间的正响应关系及其与NO₃^--N之间的负响应关系显著增强。因此,多环境因子对水生生物的影响不容忽视,在大型底栖动物生物多样性保护中应关注各类环境因子的影响贡献。     

基于线粒体cox1片段序列胶州湾浮游动物物种组成分析

基于cox1片段序列的DNA条形码为浮游动物种类鉴定提供了新的可靠手段,构建了胶州湾网采浮游动物DNA条形码文库,在国内首次使用宏遗传组学方法研究夏季胶州湾海洋浮游动物的群落组成。共获得环境样品DNA条形码149条;以6%为阈值共检出37个OUT,其中19个与DNA条形码数据库中序列程度非常高（〉97%）,可以鉴定到种...     

东太平洋赤道海域鸢乌贼(Sthenoteuthis oualaniensis)和茎柔鱼(Dosidicus gigas)的食性比较研究

柔鱼亚科(Ommastrephinae)近缘种鸢乌贼(Sthenoteuthisoualaniensis)和茎柔鱼(Dosidicus gigas)为重要的大洋性经济头足类,二者在东太平洋赤道海域均有分布。研究以同一航次捕获的两种头足类为研究对象,结合传统胃含物分析和DNA条形码技术对二者食物组成及其差异开展研究,以分析同域近缘头足类间的摄食习性及差异。结果表明,鸢乌贼和茎柔鱼均以鱼类、头足类和甲壳类为主要食物来源,ANOVA显示,两者在Shannon多样性指数和饵料生物头足类和鱼类N%上均存在显著差异, SIMPER分析进一步表明,种间胃含物组成差异最主要体现在鱼类的种类组成和个数百分比上。研究结论直观反映了同域近缘头足类物种食物特化的现象,为后续探究头足类近缘种共存机制提供了数据支持。     

eDNA监测方法标准化框架及未来图景

eDNA (environmental DNA)是指从环境样品（水体、土壤、沉积物、空气、混合物等）中提取的DNA,是各种生物的DNA混合物,区别于传统从单物种样品中提取的DNA。eDNA监测是指从环境样品中提取DNA,用物种特异性引物或特定DNA metabarcoding引物对其进行扩增测序、分类学分析、相对丰度分析、功能预测等,以监测环境中是否存在某特定物种,或者获得环境中物种组成、群落结构、生态功能等相关信息。eDNA监测主要应用在特定物种监测检出、生物多样性调查评估、群落结构和功能分析、生态系统过程分析评估等领域。eDNA监测可以应用在陆地、水体、空气、器物表面、生物（内）表面等任何有可能存在不确定DNA的场景。因为eDNA监测的非侵入性、灵敏检出、大类群检出、易标准化方法与结果、低人力物力时间成本、结果可核查等特点,未来很有希望发展成为一种常规的物种监测、群落功能预测、生态过程分析的方法,对象可涵盖所有生境条件下的所有生物类群。但要实现这个图景,需要从普遍性和特殊性层面完成eDNA监测技术链条中10个关键环节的技术标准化：样品重复数设计、采样时间设计、采样点设计、采样方法设...     

Darstellung der mikrobiellen Besiedlungsstruktur verschiedener Grundwasserhabitate durch Anwendung molekularbiologischer Methoden

Community Structures of Different Groundwater Habitats Investigated Using Methods of Molecular Biology The degradation of pollutants in groundwater and aquifers depends on microbiological and hydrogeochemical processes. To understand the transport and fate of anthropogenic compounds during bank filtration and artificial recharge of groundwater it is necessary to gain more information about the structure of microbial populations in these systems. The population structure of aerobic, anaerobic groundwater habitats and of water samples during artificial groundwater recharge was examined by 16S rDNA based analysis. Water and sediment samples were collected from a groundwater catchment area with artificial groundwater recharge near the river Ruhr in NW-Germany. 16S rRNA genes of mixed bacterial DNA from different samples were amplified by PCR (polymerase chain reaction) with eubacterial primer sequences. To reveal eubacterial population structure amplified PCR-products were separated by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) on the basis of melting domain structure and nucleotide composition. DGGE patterns of groundwater enrichment cultures and groundwater samples were compared to demonstrate differences between the use of cultivation dependent and molecularbiological approaches. The DGGE pattern of groundwater is very complex and differs significantly from DGGE patterns of groundwater enrichment cultures characterized by a small number of distinct bands. This shows the small quantity of culturable microorganisms in groundwater eco-systems. Aerobic and anaerobic groundwater and sediment samples differ markedly in their DGGE profiles. Different hydrogeochemical zones of this groundwater catchment area are mirrowed by distinct DGGE patterns indicating changes in microbial community structure.Analysis of bacterial population structure in the course of artificial groundwater recharge shows identical DGGE patterns comparing surface water samples to samples taken be-fore gravel prefiltration and before sand filtration. In contrast the DGGE pattern of artificial recharged groundwater differs markedly, indicating significant changes in microbial population during underground passage.     

基于DNA条形码技术的珠江口春季鱼卵和仔稚鱼种类组成和分布特征的研究

采用线粒体COⅠ和12S rRNA基因片段作为DNA条形码,分析珠江口春季鱼卵和仔稚鱼种类组成和分布特征,并探究两种条形码在鱼卵和仔稚鱼种类鉴定中的适用性。研究共扩增样本391个,成功鉴定的鱼卵和仔稚鱼共7目25科42属60种（2种未鉴定到种）。其中,以鲈形目（Perciformes）种类和数量最多,种类数占比为51.6%,数量占比为47.91%;其次为鲱形目（Clupeiformes）,种类数占比为25%,数量占比为34.56%。优势种10种,其中凤鲚（Coilia mystus）优势度最高,为0.071;棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）最低,为0.014。COⅠ和12S rRNA基因片段扩增结果显示,鱼卵和仔稚鱼12S rRNA基因片段扩增成功率（95.60%）明显高于COⅠ基因（43.22%）。遗传距离和ABGD分析显示,COⅠ基因种内遗传距离为0～0.005（平均0.003）,种间遗传距离为0.061～0.376（平均0.253）,两者间存在明显的“条形码间隙”,ABGD划分结果与数据库比对结果一致;12S rRNA基因种内遗传距离为0～0.011（平均0.007）,种间遗传距离为0.007～0.487（平均0.283）,龟鰉（Chelon haematocheila）和前鳞龟鰉（Chelon affinis）种间遗传距离与种内遗传距离不形成“条形码间隙”,ABGD将其划分为同一种。系统发育分析显示,在种的分类阶元,所有物种均能聚为独立分支,得到有效区分。综上,线粒体COⅠ和12S rRNA条形码可有效鉴定珠江口大多数鱼卵和仔稚鱼,但是COⅠ基因扩增成功率较低,12S rRNA基因部分近缘物种存在区分困难的情况,两种基因结合使用更能提高鱼卵和仔稚鱼种类鉴定的成功率和准确性。