海湾扇贝病原菌(飘浮弧菌)的研究

１９９６年４～５月山东省莱州市大华水产实业公司育苗场海湾扇贝亲贝发生了一起严重的流行病。这种病的主要症状是肠道及肾肿胀、生殖腺及外套膜萎缩、壳内面变黑。自发病亲贝肾组织中分离到细菌作纯培养,经肌肉注射和浸浴法人工感染健康亲贝,得到与发病池中患病亲贝相同的症状,并从人工感染病贝的肾组织中重新分离到同种细菌,证明所分离菌是发病亲贝的病原菌。经６０项形态及生理生化特性鉴定为飘浮弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎ）。应用药敏纸片法研究了４３种化学疗剂对所分离的扇贝病原菌生长的抑制作用,其中新霉素Ｂ（１００μｇ／片）、氯霉素（３０μｇ／片）、磺胺药＋ＴＭＰ（２０μｇ／片）、美洛西林（３０μｇ／片）及多粘菌素Ｂ（３００ｉｕ／片）的抑菌力最强。     

Serratia sp.对铜绿微囊藻、斜生栅藻的溶藻效果

【目的】探讨一株溶藻菌S6(Serratia sp.)对富营养化水中优势蓝藻和绿藻的溶藻效果,为有害藻类的生物控制提供参考。【方法】从富营养化水体中分离到一株溶藻菌S6(Serratia sp.,GenBank登录号为KY462187),将不同浓度菌液分别加至铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）以及两者以浓度比1∶1混合的藻液（下称“混合藻”）中,进行溶藻实验,测定14 d内实验体系中藻的生物量、叶绿素a、氨氮和总磷（TP）浓度,分析溶藻菌S6对不同藻类的溶藻效果以及对水体中氮磷的影响;运用光谱技术分析溶藻产物特性。【结果与结论】溶藻菌S6对铜绿微囊藻、斜生栅藻和混合藻的溶藻效果较佳,且菌液浓度越高,溶藻效果越佳,其中3组原菌液（2×109mL-1）处理组14 d内的溶藻率分别为89.4%、80%、78.6%。溶藻菌S6对3种实验体系氨氮和TP浓度影响较大,原菌液处理组变化最明显,其中铜绿微囊藻藻液氨氮和TP质量浓度分别下降21.24、6.21 mg/L;斜生栅藻藻液氨氮和TP质量浓度分别下降13.19、7.5...     

鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原菌的研究

１９９７年４～５月,对花鲈（Ｌａｔｅｏｌａｂｒａｘｊａｐｏｎｉｃｕｓ）鱼苗期细菌性烂鳃和烂尾病的病原菌进行了研究。从具有明显症状的病鱼的病灶组织分离到２株致病菌Ｃ－１和Ｗ－１,经人工感染及从人工感染发病鱼体再分离的Ｗ－４和Ｗ－５菌株的再感染试验结果表明,所分离的细菌为鲈鱼苗烂尾,烂鳃病的致病菌。经６４项生物学特性,生理生化特征测试结果表明,这４株菌可归为一类,同属于鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌａｒｕｍ）。药敏试验结果表明,痢特灵、ＣＩＮ１００、ＭＥＬ２５、呋喃妥因、氯霉素、磺胺药＋ＴＭＰ和美洛西林等７种药物对病原菌有显著的抑制作用。     

大黄鱼病原弧菌拮抗菌筛选

用平板涂布法从集美海边分离到381株细菌,用平板划线法或点种法检验这些海洋细菌对两株病原弧菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的拮抗作用。从中挑选2株对海水养殖动物病原弧菌有较好拮抗作用的细菌,编号为GX75和GZ46。对拮抗菌(GX75和GZ46进行了抗菌谱测定,结果表明,GX75对9株指示菌中的副溶血弧菌、河流弧菌和坎普氏弧菌有较好的拮抗作用,GZ46对副溶血弧菌、溶藻弧菌和坎普氏弧菌有较好的桔抗作用。在营养肉汤中,测定了GX75和GZ46的抗菌作用,表明(GX75和GZ46对副溶血弧菌拮抗作用很明显。     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析

克隆得到缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2（Sc-Nramp2）基因的cDNA全长序列3 681 bp,该基因的开放阅读框有1 776 bp,编码591个氨基酸,预测分子量为65.86 kDa;其结构具有Slc11蛋白家族的典型特征,包括有10个典型的跨膜结构和2个糖基化位点。Sc-Nramp2基因3'-UTR有2个类似于脊椎动物Nramp2中铁反应控制蛋白结合位点;同源性分析表明,Sc-Nramp2和太平洋牡蛎Nramp2-like的同源性最高为71.6%。实时荧光定量PCR结果表明,Sc-Nramp2基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鳃6个组织中均有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,其次是鳃,与其他组织均有极显著性差异（P<0.01）;注射副溶血弧菌后,肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表达量较对照组显著上调（P<0.01）,且表达量呈现先上升后下降的趋势,在12 h时达到最大表达量,推测Sc-Nramp2基因参与了缢蛏非特异性免疫应答反应。     

致病性哈维氏弧菌:海洋寄生性纤毛虫的内共生细菌

哈维氏弧菌被观察到与海洋寄生性纤毛虫刺激隐核虫具有内共生现象,其作为一种致病性细菌,可导致感染刺激隐核虫的大黄鱼产生严重的继发性细菌感染。我们通过16s宏测序技术对刺激隐核虫的细菌群落进行鉴定,并通过标准的细菌培养方法分离鉴定出哈维氏弧菌。通过透射电镜和荧光原位杂交方法,在刺激隐核虫的细胞胞质中,均观察到内共生的哈维氏弧菌的存在;而在其细胞核中,则没有相关信号存在。哈维氏弧菌与刺激隐核虫的相关关系以及内共生的哈维氏弧菌对刺激隐核虫的影响作用,仍需要深入进行研究。     

海洋细菌脂肪酸的气相色谱分析

以副溶血性弧菌VP-X-3为试验对象,利用气相色谱技术分析了其细胞脂肪酸的组成和含量,以色谱峰的数量、色谱峰高及脂肪酸含量作为评价指标,探讨了不同的皂化和甲酯化条件对细菌细胞脂肪酸测定结果的影响。结果表明:皂化和甲酯化条件都对细胞脂肪酸的组成和含量产生一定的影响。较低温度皂化处理利于增加色谱峰数量和色谱峰高。甲酯化温度过高容易破坏脂肪酸,尤其是长链脂肪酸和不饱和脂肪酸的结构。高温甲酯化条件下,时间越长,甲酯化效果越差。试验得到较为理想的气相色谱前处理条件:2 mol/L NaOH-甲醇溶液2 mL,70℃水浴10 min;10%(V/V)H2SO4-甲醇溶液2 mL,70℃水浴15 min。此条件下的色谱峰的数量多达29种,色谱峰高明显高于其他处理条件下的峰高。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对青蛤(Cyclina sinensis)的毒性及半致死浓度研究

利用不同浓度的鳗弧菌对青蛤进行了急性毒性实验,观察青蛤在菌液胁迫下的存活情况,进一步统计得到鳗弧菌对青蛤的半致死浓度。结果表明,青蛤在鳗弧菌液浓度OD600为1.0—2.2范围内,胁迫96h以内死亡率呈逐渐上升趋势,并且在OD600=2.2时所有受试个体全部死亡。在相同的胁迫时间内,受试个体死亡率与胁迫浓度均呈正相关。经SPSS16.0软件分析后,最终得到鳗弧菌对青蛤的半致死浓度(LC50)为OD600=1.57,说明鳗弧菌对青蛤有明显的毒害作用。     

杂色鲍β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因的克隆和表达

从杂色鲍（Haliotis disversicolor）的表达序列标签（EST）中首先鉴定出β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因片段（beta-1,3-glucan recognition protein,saflgrp）。通过5’RACE获得5’端序列,并用由头至趾（headtotoe）PCR方法检测全长cDNA序列的正确...